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猪圆环病毒2型油乳剂灭活疫苗及其免疫效力研究

作　者: 苏金存
导　师: 王桂军；李郁
学　校: 安徽农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪圆环病毒2型 灭活疫苗 免疫剂量 免疫程序 免疫效力
分类号: S852.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


猪圆环病毒2型（PCV-2）是造成断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原,目前已呈全球分布。疫苗免疫是预防PCV-2感染的主要措施之一。为预防与控制本地区PCV-2感染,本研究经间接免疫荧光、抗原性试验,从PCV-2安徽分离株中筛选出一株疫苗候选毒株。疫苗株经适应细胞PK-15大量增殖,进行滴度测定、甲醛灭活、超滤浓缩后,制备成油佐剂灭活疫苗。研究对灭活疫苗的免疫剂量、免疫程序进行了优化,并通过攻毒保护试验对疫苗的免疫效力进行评价。1、从4株PCV-2安徽分离毒株中筛选出一株病毒PCV2-BH0801株作为疫苗候选毒株,病毒滴度为10-4.59 TCID50/0.1mL。通过对PCV-2抗体阴性的断奶仔猪进行接种试验表明该毒株具有良好的抗原性。2、将PCV-2-BH0801株接种PK-15细胞进行大量扩增,获得病毒滴度为10-4.55 TCID50/0.1mL的病毒细胞培养物。0.1%甲醛37℃条件下30小时完全灭活后,利用中空纤维超滤膜组件对病毒细胞培养物进行超滤浓缩,使病毒滴度达到≥10-5.0 TCID50/0.1mL。经油佐剂高速乳化制备成油包水型灭活疫苗,物理性状、无菌检验和安全性检验均合格。3、应用1mL、2mL和4mL等不同免疫剂量的灭活疫苗免疫21日龄断奶仔猪,免疫后对仔猪生长性能、PCV-2抗体水平进行检测。应用PCV2灭活疫苗2mL免疫剂量分别免疫14、21、28日龄仔猪,间隔14天和21天进行加强免疫4mL,免疫后对仔猪的生长性能情况及PCV-2抗体水平进行检测以优化免疫程序。结果显示,仔猪28日龄首免2mL PCV-2灭活疫苗其抗体水平上升速度快,仔猪免疫应激小,对生长性能影响小,间隔21天加强免疫4mL PCV-2灭活疫苗后抗体水平能长时间维持较高水平。4、通过免疫猪群的生长性能监测、抗体水平变化监测、病毒血症检测、病理变化观察及组织中PCV-2的检测,对PCV-2灭活疫苗的免疫效力进行了评价。结果表明,免疫组攻毒后其生长性能未受影响,抗体水平始终显著高于对照组,且均未出现病毒血症,各组织脏器均未见有明显的病理变化,也未能够检测到PCV-2;而对照组平均日增重则显著低于免疫组,攻毒后7天即能检测到病毒血症,至21天依然能够检测到病毒血症,仔猪肺脏、淋巴结、脾脏以及肾脏均有不同程度的病变,且在肺脏和淋巴结组织中检测到PCV2。说明本研究制备的PCV2灭活疫苗对仔猪有良好的保护作用。5、研究还对攻毒保护试验仔猪血清中Th1细胞分泌的IL-2、IFN-γ以及Th2细胞分泌的IL-4、IL-10等细胞因子进行了检测。结果表明,免疫组感染PCV2后Th2细胞分泌的细胞因子含量明显高于Th1细胞分泌的细胞因子,但感染后期Th1细胞因子有上升的趋势,说明免疫组仔猪感染后在体液免疫反应保护下机体各项免疫反应趋于正常;感染后期对照组仔猪各细胞因子含量均低于免疫仔猪。结果表明,本研究制备的PCV-2灭活疫苗能够保护机体的免疫机制不会受到PCV2感染所致的免疫抑制。综上所述,本研究制备的PCV-2油乳剂灭活疫苗免疫仔猪后能够诱导机体产生主动免疫应答,且能够使免疫猪阻止PCV-2的感染,对猪群具有免疫保护作用。

全文目录


中文摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
附表和插图清单  12-14
主要缩略语列表  14-15
文献综述  15-30
  第一章 猪圆环病毒2 型研究进展  15-24
    1. 猪圆环病毒病原学  15-17
    2. 猪圆环病毒分子病毒学特性  17-19
    3. 猪圆环病毒2 型的流行病学  19-22
    4. 猪圆环病毒2 型的致病机理  22-23
    5. 猪圆环病毒病的预防与控制  23-24
  第二章 猪圆环病毒2 型疫苗研究进展  24-30
    1. 灭活疫苗  24-25
    2. 活载体疫苗  25-26
    3. 重组嵌合疫苗  26
    4. 核酸疫苗  26-27
    5. 弱毒活疫苗  27-28
    6. 亚单位疫苗  28-29
    7. 展望  29-30
1 引言  30-31
2 材料与方法  31-43
  2.1 材料  31-34
    2.1.1 病毒  31
    2.1.2 细胞  31
    2.1.3 主要试剂及试剂盒  31
    2.1.4 主要溶液及培养基的配制  31-33
      2.1.4.1 细胞培养相关溶液  31-32
      2.1.4.2 病毒DNA 提取相关溶液  32
      2.1.4.3 PCR 检测相关溶液  32-33
      2.1.4.4 间接免疫荧光试验相关溶液  33
    2.1.5 主要仪器设备  33
    2.1.6 试验动物  33-34
  2.2 方法  34-43
    2.2.1 病毒的增殖培养  34
    2.2.2 PCV-2 的PCR 检测  34-35
      2.2.2.1 病毒DNA 的提取  34
      2.2.2.2 PCV-2 ORF2 特异性引物  34
      2.2.2.3 PCR 反应  34-35
    2.2.3 分离毒株的TCID50 测定和疫苗候选毒株  35
      2.2.3.1 准备细胞  35
      2.2.3.2 病毒接种及培养  35
      2.2.3.3 间接免疫荧光染色及计算分离毒株的TCID50  35
    2.2.4 疫苗候选毒株的抗原性试验  35-37
      2.2.4.1 试验动物分组  35
      2.2.4.2 攻毒方案  35-36
      2.2.4.3 血液采集方案  36
      2.2.4.4 血液学部分常规指标的测定  36
      2.2.4.5 血清中总蛋白、白蛋白及球蛋白的测定  36
      2.2.4.6 血清中Ig-G、Ig-M 及Ig-A 的测定  36
      2.2.4.7 血清中PCV-2 特异性抗体监测  36-37
      2.2.4.8 数据处理  37
    2.2.5 PCV-2 灭活疫苗的制备  37-39
      2.2.5.1 病毒的扩增培养  37
      2.2.5.2 病毒细胞培养物灭活及灭活效果检验  37
      2.2.5.3 灭活病毒液的超滤浓缩  37-38
      2.2.5.4 灭活疫苗的制备及物理性状的检验  38-39
      2.2.5.5 灭活疫苗的无菌及安全性检验  39
    2.2.6 灭活疫苗免疫剂量试验  39
      2.2.6.1 试验动物分组  39
      2.2.6.2 免疫方案  39
      2.2.6.3 血液采集方案  39
      2.2.6.4 不同免疫剂量对仔猪生长性能的影响  39
      2.2.6.5 血清中PCV-2 特异性抗体水平的监测  39
      2.2.6.6 数据处理  39
    2.2.7 灭活疫苗免疫程序优化试验  39-40
      2.2.7.1 试验动物分组及免疫方案  39-40
      2.2.7.2 血液采集方案  40
      2.2.7.3 不同免疫程序对仔猪生长性能的影响  40
      2.2.7.4 血清中PCV-2 特异性抗体水平的监测  40
      2.2.7.5 数据处理  40
    2.2.8 PCV-2 灭活疫苗免疫效力试验  40-43
      2.2.8.1 试验动物分组  40
      2.2.8.2 免疫及攻毒方案  40-41
      2.2.8.3 血液采集方案  41
      2.2.8.4 攻毒保护试验仔猪生长性能的影响  41
      2.2.8.5 攻毒仔猪临床表现及病理变化  41
      2.2.8.6 攻毒仔猪血清中PCV-2 特异性抗体水平的监测  41
      2.2.8.7 攻毒仔猪血清中部分细胞因子含量的检测  41-42
      2.2.8.8 攻毒仔猪血清中PCV-2 的检测  42
      2.2.8.9 攻毒仔猪组织中PCV-2 的检测  42
      2.2.8.10 数据处理  42-43
3 结果与分析  43-61
  3.1 分离毒株的TCID50 测定和疫苗候选毒株  43
  3.2 疫苗候选毒株的抗原性试验  43-47
    3.2.1 血液学部分常规指标的测定  43-45
    3.2.2 血清中总蛋白、白蛋白及球蛋白的测定  45
    3.2.3 血清中Ig-G、Ig-M 及Ig-A 的测定  45-46
    3.2.4 血清中PCV-2 特异性抗体监测  46-47
  3.3 PCV-2 灭活疫苗的制备  47-48
    3.3.1 病毒的扩增培养  47
    3.3.2 病毒细胞培养物灭活及灭活效果检验  47-48
    3.3.3 灭活病毒液的超滤浓缩  48
    3.3.4 灭活疫苗的物理性状的检验  48
    3.3.5 灭活疫苗的无菌检验  48
    3.3.6 灭活疫苗的安全性检验  48
  3.4 灭活疫苗免疫剂量试验  48-50
    3.4.1 不同免疫剂量对仔猪生长性能的影响  48-49
    3.4.2 不同免疫剂量仔猪血清中PCV-2 特异性抗体水平变化  49-50
  3.5 灭活疫苗免疫程序优化试验  50-55
    3.5.1 不同免疫程序对仔猪生长性能的影响  50
    3.5.2 不同免疫程序仔猪血清中 PCV-2 特异性抗体水平变化  50-55
  3.6 PCV-2 灭活疫苗免疫效力试验  55-61
    3.6.1 攻毒保护试验仔猪生长性能的影响  55
    3.6.2 攻毒保护试验仔猪血清中 PCV-2 特异性抗体水平的监测  55-56
    3.6.3 攻毒保护试验仔猪血清中部分细胞因子含量的变化  56-57
    3.6.4 攻毒保护试验仔猪血清中 PCV-2 的检测  57-58
    3.6.5 攻毒保护试验仔猪临床症状、病理变化及组织中 PCV-2 的检测  58-61
4 讨论  61-64
5 结论  64-65
参考文献  65-69
致谢  69-70
个人简介  70
在读期间发表的学术论文  70

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 血清学
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