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盐酸阿霉素脂质体脑胶质瘤靶向研究

作　者: 梅丹宇
导　师: 蒋新国；庞志清
学　校: 复旦大学
专　业: 药剂学
关键词: 阿霉素脂质体靶向递送 Angiopep-2 C6脑胶质瘤药物动力学
分类号: R739.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

脑胶质瘤约占颅内肿瘤的46%,临床治疗首选手术切除。由于胶质瘤生长部位的特殊性,手术通常不能将其切除完全,所以通常还须辅以放、化疗等治疗手段。胶质瘤发生早期,血脑屏障(Blood brain barrier, BBB)比较完整；随着病程发展,肿瘤组织生成大量新生血管,其血管内皮细胞间隙可达50-300nm；由于肿瘤边缘部位与正常脑组织浸润生长,通常手术不予切除,此部位BBB可认为仍较完整,针对此部位的后续治疗对胶质瘤治疗的预后至关重要。本课题将抗肿瘤药物阿霉素包封于粒径控制在100nm左右的脂质体内,并将脂质体连接靶向功能基Angiopep-2,该功能基能靶向在BBB和胶质瘤细胞高表达的低密度脂蛋白受体相关蛋白,使脂质体具有脑胶质瘤靶向性,达到增强药物对病灶部位的作用并减少全身毒副作用的效果。本文第一章为阿霉素(DOX)脂质体的制备和理化表征,进行了脂质体处方筛选和制备工艺优化,优化后的脂质体处方药/脂比为1:25, DPPC/PEG-DSPE/ DSPE-PEG-MAL为90：10：2,粒径约为100 nm, Zeta电位-8 mV左右。采用薄膜水化法制备空白脂质体,DSPE-PEG-MAL在脂质体表面的马来酰亚胺基与Angiopep-2共价连接；pH梯度法载药得到阿霉素脂质体(AL),包封率达到99%以上。采用大鼠脑胶质瘤细胞(C6)作为体外考察的细胞模型,对AL的脑胶质瘤递药特性进行体外评价,并与游离阿霉素及普通阿霉素脂质体(NL)进行比较。C6摄取的定性观察结果显示,其对AL的摄取高于NL,显示出AL一定的肿瘤靶向性。第二部分建立了盐酸阿霉素体内样品分析的LC-MS/MS方法,采用C6细胞株建立小鼠的脑胶质瘤模型,组织和细胞水平验证结果表明模型构建成功。以NL和DOX作为对照,采用药动学方法考察了AL药时曲线及脑内、脑胶质瘤和其他组织的分布特性。结果发现,三组制剂药物在体内快速分布,较缓慢消除,均符合三室模型。与DOX相比,脂质体制剂能显著延长阿霉素血液循环时间,增加药物入脑机会；与NL相比,经过Angiopep-2修饰的AL在脑和肿瘤中的AUCo-t分别是前者的2.92和7.76倍,脑靶向指数为2.8,说明AL具有一定的脑靶向性；组织分布结果表明,AL在脑组织滞留时间较长。以上结果证实,优化后的AL在体内能够增加药物的脑内转运,具有一定的脑和脑胶质瘤递药特性,是一种较为理想的脑靶向递药系统。为了考察AL对于脑胶质瘤的治疗效果,第三部分采用C6细胞株建立小鼠的脑胶质瘤模型,以生理盐水组、DOX组、NL组作为对照进行实验研究。以肿瘤体积为主要考察指标,比较各组制剂的抑瘤效果；并对肿瘤部位进行病理学检查和TUNEL细胞凋亡检测。以小鼠体重变化为指标初步分析各制剂对小鼠生存状况的影响,最后对各组进行生存期分析。结果表明,给药三次后,生理盐水阴性对照组瘤体积约为68.63±30.80 mm3,DOX组瘤体积为36.47±12.00 mm3,NL组瘤体积为11.93±4.21mm3,AL组瘤体积为5.39±4.27 mm3,AL组瘤体积显著性小于其余各组；肿瘤部位细胞凋亡明显增加；小鼠体重增重较其余阿霉素治疗组多；小鼠中位生存时间显著高于生理盐水组和DOX组,高于NL组但无显著性差异。以上结果说明Angiopep-2修饰的阿霉素脂质体AL具有一定的脑胶质瘤靶向治疗效果。

全文目录

中文摘要  5-7
Abstract  7-10
前言  10-13
第一章盐酸阿霉素脂质体的制备、表征及体外评价  13-26
  1 仪器和材料  14-15
    1.1 仪器  14
    1.2 材料和试剂  14-15
    1.3 溶液的配制  15
  2 实验方法和结果  15-24
    2.1 DOX含量测定的高效液相色谱法  15-18
      2.1.1 色谱条件  15-17
      2.1.2 标准曲线的绘制  17
      2.1.3 溶液的配制  17
      2.1.4 精密度考察  17
      2.1.5 回收率试验  17-18
    2.2 脂质体的包封率  18
    2.3 处方工艺研究  18-19
    2.4 靶向功能基Angiopep-2连接效率研究  19-20
      2.4.1 脂质体与靶向功能基Angiopep-2连接  19
      2.4.2 Ellmann's试剂测定连接效率  19-20
    2.5 NL和AL的制备  20-21
    2.6 脂质体的理化性质表征  21-23
      2.6.1 脂质体外观考察  21
      2.6.2 脂质体粒径和Zeta电位测定  21-22
      2.6.3 脂质体透射电镜照片  22-23
      2.6.4 脂质体包封率测定  23
    2.7 DOX、NL、AL大鼠C6细胞摄取的定性观察  23-24
  3 讨论  24
    3.1 载药机理分析  24
    3.2 脂质体粒径大小的选择  24
    3.3 C6细胞摄取荧光强度分析  24
  4 小结  24-26
第二章盐酸阿霉素脂质体在C6脑胶质瘤模型鼠体内的药动学研究  26-42
  1 仪器和试剂  26-27
    1.1 仪器  26
    1.2 材料和试剂  26-27
    1.3 实验动物  27
    1.4 软件  27
  2 方法和结果  27-40
    2.1 液质联用测定小鼠血浆及组织样品含量  27-33
      2.1.1 色谱条件及质谱条件  27-28
      2.1.2 样品处理  28
      2.1.3 专属性  28-31
      2.1.4 血和各组织的标准曲线及检测限  31-32
      2.1.5 回收率和精密度试验  32-33
    2.2 DOX、NL以及AL的体内药动学研究  33-40
      2.2.1 C6脑胶质瘤小鼠模型的建立  33
      2.2.2 模型的验证  33-35
      2.2.3 给药方案  35
      2.2.4 数据处理  35-40
  3 讨论  40-41
    3.1 C6胶质瘤模型建立手术注意事项  40-41
    3.2 C6脑胶质瘤模型与药动学研究  41
    3.3 体内外相关性问题  41
  4 小结  41-42
第三章盐酸阿霉素脂质体治疗C6脑胶质瘤鼠模型  42-50
  1 仪器与材料  42-43
    1.1 仪器  42
    1.2 材料与试剂  42
    1.3 实验动物  42
    1.4 统计软件  42-43
  2 实验方法和结果  43-49
    2.1 小鼠C6脑胶质瘤模型的建立  43
    2.2 实验分组与治疗方案  43
    2.3 药效学实验评价方法  43-49
      2.3.1 组织水平的病理解剖学评价  43-44
      2.3.2 细胞水平评价  44-46
      2.3.3 小鼠体重变化情况  46-47
      2.3.4 生存曲线  47-49
  3 讨论  49
    3.1 药动学和药效学实验结果的相关性分析  49
    3.2 阿霉素脂质体的药效与毒副作用  49
  4 小结  49-50
全文总结  50-52
参考文献  52-56
综述  56-64
  参考文献  61-64
致谢  64-66
在校期间发表论文  66
参加科研项目  66-67

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