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辅酶Q_（10）高产菌株的选育及发酵工艺研究

作　者: 焦雪茜
导　师: 石贵阳
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: 辅酶Q10 根癌土壤杆菌 诱变育种 条件优化 连续流加分批发酵
分类号: Q552
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 83次
引　用: 2次
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内容摘要


辅酶Q10是一种脂溶性醌类化合物,它作为呼吸链中重要的递氢体主要分布于真核生物的线粒体内膜及原核生物的质膜上。辅酶Q10具有多种生理活性,它在医药、食品和化妆品等行业具有很大的应用潜力。虽然采用微生物发酵法大量获得辅酶Q10较为可行,但现阶段辅酶Q10较低的生产能力却限制了它的大量使用。基于上述原因,本文对辅酶Q10产生菌的选育及发酵工艺进行了研究。第一阶段,首先以根癌土壤杆菌(Rhizobium radiobacter)为出发菌株,以辅酶Q10的结构类似物维生素K3及糖苷类抗生素作为筛选因子,确定了快速高效筛选辅酶Q10高产突变株的方法。确定维生素K3的最小抑制浓度为0.04 g/L,丁胺卡那霉素和硫酸庆大霉素分别为0.025 g/L和0.0048 g/L。其次,确定了诱变条件。其中紫外照射时间15 s,脉冲注入N+离子能量为10 keV,剂量采用20×1014 ion/cm2。最终,经紫外线和离子束双重诱变,结合抗性平板初筛、摇瓶初筛和复筛获得了3株高产菌株K-53 (101.1 mg/L)、Q-18 (104.7 mg/L)和Y80-58-2 (105.8 mg/L),与出发菌株(63.7 mg/L)相比产量分别提高了58.7%、64.4%和66.1%。尽管产量不是最高,2株产生性状变异的突变株Q-14 (94.77 mg/L)和Y80-88-1 (97.01mg/L)却表现出了值得关注的特性。5代的传代稳定性实验表明,高产菌株的辅酶Q10产量较稳定。第二阶段,在15 L通气搅拌发酵罐规模对菌种培养条件进行了研究。首先考察了3株高产或者性状变异特性突变株的分批发酵和流加葡萄糖的补料分批发酵过程。最终选择了性能最佳的突变株Q-14。然后,通过在线控制pH值及分批补加葡萄糖和新鲜培养基,辅酶Q10的产量提高到691.12 mg/L。为了避免产生葡萄糖抑制效应,采取连续流加葡萄糖的方式替代分批流加,使得产量增加到803.59 mg/L。最后,通过检测发酵过程中的磷含量,采用连续流加KH2PO3维持发酵液中的磷在一定水平,进一步提高了产量。最终,通过对培养条件的优化,突变株Q-14在15 L搅拌发酵罐内生产辅酶Q10的产量达到了2166.20 mg/L,生产强度25.878 mg/(L·h),产物对菌体得率YP/X为25.036 mg/g。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-8
第一章 绪论  8-14
  1.1 辅酶Q_(10) 的结构和性质  8
    1.1.1 辅酶Q_(10) 的结构  8
    1.1.2 辅酶Q_(10) 的理化性质  8
  1.2 辅酶Q_(10) 的制备方法  8
  1.3 辅酶Q_(10) 的功能及应用  8-9
  1.4 辅酶Q_(10) 的研究现状  9-12
    1.4.1 菌种选育及采用合适方法筛选突变株  9-10
    1.4.2 基因工程菌的构建与分子改造  10-11
    1.4.3 发酵过程控制及培养条件优化  11-12
    1.4.4 辅酶Q_(10) 的分离与纯化  12
  1.5 立题意义  12-13
  1.6 本论文的主要研究内容  13-14
第二章 材料与方法  14-22
  2.1 实验材料  14-15
    2.1.1 菌种  14
    2.1.2 主要试剂与材料  14
    2.1.3 主要仪器与设备  14-15
  2.2 实验方法  15-22
    2.2.1 培养基及培养方法  15
    2.2.2 诱变方法  15-16
    2.2.3 筛选平板的制备方法  16
    2.2.4 辅酶Q_(10) 高产菌株的筛选  16-17
    2.2.5 维生素缺陷型的确定  17
    2.2.6 辅酶Q_(10) 高产菌株的发酵扩大培养  17
    2.2.7 辅酶Q_(10) 的提取方法  17
    2.2.8 高效液相色谱法测定辅酶Q_(10) 的产量  17-18
    2.2.9 标准曲线的绘制方法  18
    2.2.10 微量磷的测定方法  18-20
    2.2.11 发酵液中成分的测定  20-22
第三章 结果与讨论  22-44
  3.1 出发菌株的选择  22
  3.2 生长曲线的测定及辅酶Q_(10) 产量随发酵时间的变化曲线  22-23
    3.2.1 生长曲线的测定  22
    3.2.2 辅酶Q_(10) 的产量随发酵时间的变化曲线  22-23
  3.3 HPLC 检测辅酶Q_(10) 标准曲线的绘制  23
  3.4 紫外诱变和离子束诱变  23-26
    3.4.1 紫外诱变  23-24
    3.4.2 离子束诱变  24-26
  3.5 快速筛选方法的确定及诱变结果  26-30
    3.5.1 辅酶Q_(10) 结构类似物最小抑制浓度的确定  26-27
    3.5.2 丁胺卡那霉素和硫酸庆大霉素最小抑制浓度的确定  27
    3.5.3 第一轮紫外诱变结果  27-28
    3.5.4 第二轮紫外诱变及离子束诱变结果  28-30
  3.6 维生素缺陷型的确定  30-31
  3.7 高产菌株诱变选育谱系及传代稳定性实验  31-32
  3.8 发酵扩大培养  32-43
    3.8.1 扩大培养最佳菌株的选择  32-35
    3.8.2 pH 值对Q-14 发酵的影响  35-36
    3.8.3 补加新鲜培养基对辅酶Q_(10) 发酵的影响  36-37
    3.8.4 连续流加葡萄糖对辅酶Q_(10) 发酵的影响  37-40
    3.8.5 无机磷含量对辅酶Q_(10) 发酵的影响  40-41
    3.8.6 小结  41-43
  3.9 主要结论  43
  3.10 展望  43-44
致谢  44-46
参考文献  46-49
附录A：作者在攻读硕士学位期间发表的论文  49-50
附录B：初筛菌株编号及产量  50-54

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 酶 > 辅酶
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