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微生物发酵法生产辅酶Q_（10）

作　者: 张晓军
导　师: 王普
学　校: 浙江工业大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 辅酶Q10 发酵 菌种选育 工艺优化 响应面
分类号: TQ925.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


辅酶Q10作为生物体有氧呼吸链中不可缺少的电子递氢体，广泛应用于生物医药、化妆品、保健品等领域。微生物发酵法生产辅酶Q10具有产物活性高、原料成本低等优点，成为当前研究与开发的热点。本文对采自于省内外不同地区的20余份土样以及实验室保藏的12株菌株进行了初筛、复筛，获得一株具有较高生产性能的辅酶Q10生产菌株CG。根据辅酶Q10的生物合成途径和代谢调控原理，运用γ射线、微波、UV、UV结合LiCl等诱变因子并结合理性化筛选，对CG进行了推理选育，获得一株优良菌株PN251，其生物量为6.21g／L，辅酶Q10产量为11.2mg／L，产量比出发菌株提高了255％。该菌株遗传性能稳定，经传接8代，辅酶Q10产量仍保持在原发酵水平的97.3％。在单因素实验的基础上，利用MINITAB软件的Plackett-Burman设计法和DPS统计软件的响应面分析法对PN251的发酵工艺进行了优化，得到较适的培养基组成为：葡萄糖2.51％，蛋白胨0.53％，酵母粉0.3％，K2HPO4 0.05％，KH2PO4 0.03％，MgSO4 0.03％，PHB 0.226％，豆油3％；较适的培养条件为：接种量为5％，培养基初始pH为6.0，发酵温度为30℃，摇瓶装量为250ml三角瓶装料40ml培养基，摇床转速为180r／min。优化后的辅酶Q10产量可达35.5mg／L，较优化前提高217％。5L发酵罐上的分批发酵和流加发酵试验表明：分批发酵的最佳发酵周期为40h，其对应的辅酶Q10产量为39.8 mg／L。采用流加发酵方式，即在发酵24 h-33 h时，以10 ml／h的添加量流加豆油，辅酶Q10含量可达48.7 mg／L，较分批培养提高了22.3％。产物合成周期延长至52 h。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
第一章 文献综述  12-30
  1.1 辅酶Q_(10)简介  12-16
    1.1.1 辅酶Q_(10)的理化性质  12-13
    1.1.2 辅酶Q_(10)的生产方法  13-14
      1.1.2.1 动植物组织提取法  13
      1.1.2.2 化学合成法  13-14
      1.1.2.3 动植物组织培养法  14
      1.1.2.4 微生物发酵法  14
    1.1.3 辅酶Q_(10)的功能及作用  14-16
      1.1.3.1 在生物体细胞呼吸和能量代谢中的作用  14
      1.1.3.2 在抗肿瘤中的作用  14-15
      1.1.3.3 在治疗心血管疾病方面的作用  15
      1.1.3.4 在增强人体免疫力方面的作用  15
      1.1.3.5 在清除自由基和抗氧化方面的作用  15-16
      1.1.3.6 其他生理功能  16
  1.2 辅酶Q_(10)的生物合成途径  16-21
    1.2.1 辅酶Q_(10)结构和合成前体  16
    1.2.2 芳香环的合成途径  16-18
      1.2.2.1 对羟基苯甲酸的生物合成  17
      1.2.2.2 芳香环的修饰  17-18
    1.2.3 聚-2-甲基丁烯(2)基侧链的生物合成途径  18-21
      1.2.3.1 侧链前体的合成途径  18-20
      1.2.3.2 侧链的合成  20-21
  1.3 辅酶Q_(10)的发酵生产  21-28
    1.3.1 辅酶Q_(10)生产菌株  21-23
      1.3.1.1 产辅酶Q_(10)的微生物类型  21-22
      1.3.1.2 对菌种的遗传改造  22-23
    1.3.2 辅酶Q_(10)发酵工艺  23-25
      1.3.2.1 培养基成分的优化  23-24
      1.3.2.2 培养条件的优化  24-25
      1.3.2.3 培养方式的影响  25
    1.3.3 发酵液中辅酶Q_(10)的提取工艺  25-27
      1.3.3.1 皂化法提取分离  25-26
      1.3.3.2 溶剂萃取  26-27
      1.3.3.3 吸附层析法  27
      1.3.3.4 超临界萃取  27
    1.3.4 辅酶Q_(10)的检测方法  27-28
      1.3.4.1 定性分析  27-28
      1.3.4.2 定量分析  28
  1.4 本论文的主要研究内容  28-30
第二章 材料与方法  30-37
  2.1 实验材料  30-31
    2.1.1 菌种  30
    2.1.2 培养基  30
    2.1.3 仪器及设备  30-31
    2.1.4 试剂  31
  2.2 实验方法  31-37
    2.2.1 培养方法  31-32
      2.2.1.1 斜面培养  31
      2.2.1.2 种子培养  31
      2.2.1.3 发酵培养  31-32
    2.2.2 辅酶Q_(10)的提取方法  32
    2.2.3 还原糖的测定方法  32-33
    2.2.4 氨基氮的测定  33
    2.2.5 生物量的测定  33-35
      2.2.5.1 比浊法  33-34
      2.2.5.2 细胞干重的测定  34
      2.2.5.3 发酵液浊度与细胞干重的关系  34-35
    2.2.6 辅酶Q_(10)含量的测定  35-37
      2.2.6.1 薄层层析法  35
      2.2.6.2 紫外分光光度法  35-36
      2.2.6.3 高效液相色谱法  36-37
第三章 辅酶Q_(10)高产菌株的选育  37-58
  3.1 材料与方法  38-41
    3.1.1 材料  38-39
      3.1.1.1 土样  38
      3.1.1.2 菌种  38
      3.1.1.3 培养基  38-39
    3.1.2 实验方法  39-41
      3.1.2.1 辅酶Q_(10)产生菌株的筛选  39-40
      3.1.2.2 辅酶Q_(10)高产菌株选育  40-41
      3.1.2.3 培养方法  41
      3.1.2.4 提取方法  41
      3.1.2.5 分析方法  41
  3.2 结果与讨论  41-56
    3.2.1 辅酶Q_(10)产生菌株的筛选  41-43
      3.2.1.1 土样采集、菌种富集和分离  41
      3.2.1.2 初筛  41-42
      3.2.1.3 复筛  42-43
      3.2.1.4 较佳产生菌株的确定  43
    3.2.2 辅酶Q_(10)产生菌的选育  43-55
      3.2.2.1 出发菌株CG的分离纯化  43-44
      3.2.2.2 Co~(60)-γ射线诱变育种结果  44-45
      3.2.2.3 微波诱变育种  45-47
      3.2.2.4 紫外线诱变结果  47-49
      3.2.2.5 紫外线结合氯化锂的复合诱变结果  49-50
      3.2.2.6 卡那霉素抗性菌株的筛选  50-52
      3.2.2.7 代谢拮抗物抗性突变株的筛选  52-53
      3.2.2.8 耐前体突变株的筛选  53-55
    3.2.3 菌株特性的考察  55-56
      3.2.3.1 PN251菌株遗传稳定性的考察  55-56
      3.2.3.2 PN251菌株生长曲线和产物合成曲线  56
  3.3 本章小结  56-58
第四章 辅酶Q_(10)发酵工艺的优化  58-78
  4.1 材料与方法  58-59
    4.1.1 菌种  58
    4.1.2 培养基  58
    4.1.3 培养方法  58-59
    4.1.4 提取方法  59
    4.1.5 分析方法  59
  4.2 结果与讨论  59-77
    4.2.1 培养基优化  59-69
      4.2.1.1 不同种类碳源对发酵的影响  59-60
      4.2.1.2 不同种类氮源对发酵的影响  60-61
      4.2.1.3 不同种类碳、氮组合对发酵的影响  61
      4.2.1.4 葡萄糖浓度对发酵的影响  61-62
      4.2.1.5 蛋白胨浓度对发酵的影响  62-63
      4.2.1.6 复合碳源对发酵的影响  63
      4.2.1.7 复合氮源对发酵的影响  63-64
      4.2.1.8 酵母粉浓度对发酵的影响  64-65
      4.2.1.9 KH_2PO_4浓度对发酵的影响  65
      4.2.1.10 K_2HPO_4浓度对发酵的影响  65-66
      4.2.1.11 不同种类金属离子对发酵的影响  66
      4.2.1.12 MgSO_4浓度对发酵的影响  66-67
      4.2.1.13 不同浓度对羟基苯甲酸(PHB)对发酵的影响  67-68
      4.2.1.14 添加不同种类效应物对发酵的影响  68
      4.2.1.15 豆油浓度对发酵的影响  68-69
    4.2.2 培养条件优化  69-72
      4.2.2.1 培养基初始pH对发酵的影响  69
      4.2.2.2 发酵温度对发酵的影响  69-70
      4.2.2.3 接种量对发酵的影响  70-71
      4.2.2.4 装液量对发酵的影响  71
      4.2.2.5 摇床转速对发酵的影响  71-72
    4.2.3 响应面法优化发酵工艺  72-77
      4.2.3.1 Plackett-Burman设计法筛选显著因素  72-74
      4.2.3.2 响应面分析试验设计  74-77
  4.3 本章小结  77-78
第五章 5L罐发酵试验  78-83
  5.1 材料与方法  78-79
    5.1.1 菌种  78
    5.1.2 培养基  78
    5.1.3 培养方法  78-79
    5.1.4 提取方法  79
    5.1.5 分析方法  79
    5.1.6 5L发酵罐  79
  5.2 结果与讨论  79-82
    5.2.1 5L罐分批培养  79-81
    5.2.2 5L罐流加培养  81-82
  5.3 本章小结  82-83
第六章 结论与建议  83-85
  6.1 结论  83-84
  6.2 今后工作的建议  84-85
参考文献  85-91
攻读硕士期间发表和待发表的论文  91-92
致谢  92

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 酶制剂（酵素） > 其他
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