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多肽介导的诱骗子对核因子-κB活性的抑制作用

作　者: 刘颖勋
导　师: 权富生
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 发育生物学
关键词: 核因子-κB 诱骗子寡核苷酸 Sulfo-SMCC交联试剂多肽 HeLa细胞
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

核因子-κB是一类重要的转录因子,参与机体的胚胎发育、免疫应答及炎症反应等多种生物学事件。转录因子诱骗子技术是近十年来发展起来的一种研究转录因子功能的方法,该技术利用一段人工合成的与转录因子具有高亲和力的寡核苷酸,竞争性结合活化的转录因子,使其丧失与内源性基因结合的能力,下调靶基因的转录。利用诱骗子技术可有效地抑制核因子-κB的过度活化,对相关疾病起到良好的治疗作用,同时该技术也为研究核因子-κB功能开辟了新的途径。目前,已有多种转染途径能高效携带诱骗子寡核苷酸进入细胞,但寡核苷酸转染细胞后,大多聚集在细胞质中,进入细胞核的效率很低,从而限制了诱骗子对转录因子的调节功能,影响了诱骗子技术的应用。本研究旨在通过共价连接的多肽提高寡核苷酸转染细胞以及进入细胞核的效率,提高诱骗子对核转录因子的抑制效率,发展一种新型转录因子诱骗子策略。本试验以异型双功能交联剂共价交联末端氨基修饰的寡核苷酸和末端巯基修饰的多肽,合成共价结合多肽的核因子-κB诱骗子寡核苷酸;同时将合成的诱骗子寡核苷酸转染人宫颈癌HeLa细胞,倒置荧光显微镜观测带有荧光素标记的寡核苷酸在细胞内的分布,并通过凝胶迁移率变动实验检测诱骗子寡核苷酸对核因子-κB活性的抑制作用。结果显示,多肽分子成功连接到寡核苷酸上,通过积分光密度分析产物得率为18.2 %;在脂质体和细胞跨膜肽介导下寡核苷酸转染细胞的效率高达100 %,远高于寡核苷酸直接转染细胞;寡核苷酸在核定位信号多肽以及细胞跨膜肽与核定位信号多肽融合肽(MGP)介导下可穿越细胞质膜和核孔复合体,直接进入细胞核。凝胶迁移率变动实验结果显示核定位信号多肽与MGP多肽介导诱骗子对核内活化的核因子-κB的活性的抑制效率高于其他对照组。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-8
第一章 NF-ΚB DECOY 序列设计和转导效率的研究进展  8-21
  1.1 NF-ΚB 生物学特性  8-9
    1.1.1 NF-κB 家族成员  8
    1.1.2 NF-κB 的活化  8-9
  1.2 NF-ΚB 对胚胎发育的调控  9-12
    1.2.1 NF-κB 对早期胚胎发育的影响  9-10
    1.2.2 NF-κB 与胚胎细胞的增殖、分化和器官发生  10
    1.2.3 NF-κB 参与分娩发动和早产  10
    1.2.4 NF-κB 对早期胚胎及妊娠期乳腺发育的影响  10-11
    1.2.5 NF-κB 与妊娠期相关疾病发生密切相关  11
    1.2.6 转录因子诱导体细胞重编程逆转为干细胞  11-12
  1.3 NF-ΚB DECOY 策略  12-13
  1.4 核转录因子 DECOY 的化学修饰  13-15
  1.5 DECOY 高效转导方法  15-18
  1.6 入核效率  18-19
  1.7 小结  19-21
第二章 SULFO-SMCC 介导多肽与寡核苷酸的共价连接  21-29
  2.1 材料和方法  21-23
    2.1.1 主要试剂及用品  21-22
    2.1.2 实验所用主要仪器  22
    2.1.3 主要溶液及配制方法  22-23
  2.2 方法  23-25
    2.2.1 双链ODNs 的复性  23
    2.2.2 多肽溶液的制备  23
    2.2.3 Pep-ODNs 结合物的制备  23
    2.2.4 Pep-ODNs 连接反应的改进  23-24
    2.2.5 Pep-ODNs 结合物纯化回收  24
    2.2.6 Pep-ODNs 结合物的鉴定  24-25
  2.3 结果  25-27
    2.3.1 Pep-ODNs 的连接反应  25
    2.3.2 Pep-ODNs 产物的纯化  25-26
    2.3.3 Pep-ODNs 产物的鉴定  26-27
  2.4 讨论  27-28
  2.5 小结  28-29
第三章诱骗子转染HELA 细胞及对核内NF-ΚB 活性的抑制作用  29-42
  3.1 材料和方法  29-32
    3.1.1 主要试剂及用品  29-31
    3.1.2 主要仪器设备  31
    3.1.3 主要溶液及配制方法  31-32
  3.2 方法  32-36
    3.2.1 细胞培养  32-33
    3.2.2 Pep-ODNs 转染细胞  33
    3.2.3 Pep-ODNs 连接物对细胞生长的影响  33
    3.2.4 荧光显微镜观察ODNs 细胞内分布  33
    3.2.5 凝胶电泳迁移率变化分析实验（EMSA）  33-36
    3.2.6 统计学方法  36
  3.3 结果  36-40
    3.3.1 Pep-ODNs 连接物对细胞生长的影响  36-37
    2.3.2 Pep-ODNs 在细胞内的分布  37-38
    3.3.3 NF-κB 活性的凝胶迁移实验分析  38-40
  3.4 讨论  40-41
  3.5 小结  41-42
结论  42-43
参考文献  43-49
符号说明  49-50
致谢  50-51
作者简介  51

多肽介导的诱骗子对核因子-κB活性的抑制作用

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