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基于免疫反应的高灵敏检测方法的建立

作　者: 许定花
导　师: 金征宇；胥传来
学　校: 江南大学
专　业: 制糖工程
关键词: 量子点碳纳米管免疫印迹电化学微囊藻毒素免疫分析
分类号: R115
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 43次
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内容摘要

由于量子点及碳纳米管(CNTs)独特的纳米特性及生物兼容性,它们在免疫分析领域被广泛应用。本论文分别构建了两种基于免疫反应的高灵敏检测方法。基于聚合量子点的超灵敏免疫印迹方法(western blot)用以对复杂蛋白样品进行分析检测,碳纳米管—纸免疫传感器对水中的微囊藻毒素进行检测。一种免疫方法是：基于量子点的超灵敏蛋白检测免疫印迹方法。碲化镉(CdTe)量子点由于它独特的光学及生物特性,被广泛应用于生物化学标记领域。本论文构建了一种基于量子点的超灵敏蛋白检测免疫印迹方法。由于亲和素功能化的聚合量子点的高亲和性及对检测步骤的简化,使得量化免疫印迹方法成为现实。为了制备聚合量子点,首先需要用生物素化的变性牛血清白蛋白(dBSA)包裹量子点,然后通过生物素与亲和素的相互作用,量子点相互偶联生成聚合量子点。经过一系列的修饰,碲化镉量子点的荧光强度显著增强。把聚合量子点作为免疫印迹的标志物,其追踪微量蛋白比传统染料更灵敏。以蛋白A为例,对基于聚合量子点的免疫印迹方法进行验证,检测线性范围为30pg到1.5ng,检测限达0.84pg。最终在聚偏二氟乙烯膜上的荧光信号至少可以保持40min。进行实际样品检测时,回收率达99.9％到103.0％。另一种方法是纸—单壁碳纳米管复合物组成的,简单且高效的传感器。碳纳米管传感器的电阻取决于碳纳米管网络之间的间隙宽度,该方法能很好的满足常规毒素的检测要求。本论文对微囊藻毒素进行了检测并建立了标准曲线,线性范围为1.25nmol／L到10nmol／L。检测限达0.6nmol／L(0.6ng／mL),满足了世界卫生组织关于饮用水中微囊藻毒素含量不超过1ng／mL的检测要求。同时,论文还对该方法与ELISA检测方法进行了比较。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-7
一、绪论  7-12
  1.1 量子点概论  8-9
    1.1.1 量子点的性质  8
    1.1.2 量子点的应用  8-9
  1.2 碳纳米管概述  9-10
    1.2.1 碳纳米管的性质  9
    1.2.2 碳纳米管的应用  9-10
  1.3 免疫印迹及电化学分析方法  10-11
    1.3.1 免疫印迹方法  10-11
    1.3.2 电化学分析方法  11
  1.4 本课题研究内容、目标  11-12
    1.4.1 研究内容  11
    1.4.2 研究目的  11-12
二、实验材料及方法  12-20
  2.1 实验材料  12-13
    2.1.1 实验药品  12
    2.1.2 主要溶液  12-13
    2.1.3 实验仪器  13
  2.2 基于量子点的免疫印迹新方法的实验步骤  13-17
    2.2.1 BSA的还原变性  13
    2.2.2 dBSA的琥珀酰胺生物素化(NHS-biotin-dBSA的制备)  13-14
    2.2.3 生物素化的变性BSA包裹量子点  14
    2.2.4 亲和素化荧光量子团的制备  14
    2.2.5 SDS-PAGE变性凝胶电泳  14
    2.2.6 Western blotting转移蛋白  14
    2.2.7 蛋白质鉴定(免疫检测)  14-15
    2.2.8 优化实验  15-16
    2.2.9 标准曲线的建立  16
    2.2.10 实际样品检测及回收率计算  16-17
    2.2.11 检测限的计算  17
    2.2.12 与商品化试剂盒的比较  17
  2.3 碳纳米管在免疫传感器中的应用实验步骤  17-20
    2.3.1 电极的制作  17-18
    2.3.2 微囊藻毒素的电化学检测  18
    2.3.3 扫描电镜(SEM)与原子力显微镜(AFM)  18
    2.3.4 优化实验  18
    2.3.5 对照试验  18-19
    2.3.6 添加回收率的计算  19
    2.3.7 检测限的计算  19
    2.3.8 ELISA检测步骤  19-20
三、实验结果与讨论  20-36
  3.1 基于聚合量子点的免疫印迹新方法的实验结果及讨论  20-28
    3.1.1 dBSA的琥珀酰胺生物素化鉴定  20-21
    3.1.2 生物素化的dBSA包裹量子点结果鉴定  21-23
    3.1.3 聚合量子点的生成  23
    3.1.4 条件优化  23-25
    3.1.5 标准曲线的建立  25-27
    3.1.6 荧光保留时间  27
    3.1.7 实际样品检测及添加回收率的计算  27-28
    3.1.8 与商品化试剂盒的比较  28
  3.2 碳纳米管在免疫传感器中的应用实验结果及讨论  28-36
    3.2.1 电极制作  28-29
    3.2.2 扫描电镜(SEM)与原子力显微镜(AFM)表征  29-30
    3.2.3 电极电阻值的测定  30-31
    3.2.4 条件优化  31-33
    3.2.5 标准曲线的建立  33-34
    3.2.6 添加回收率的计算  34-36
主要结论  36-37
致谢  37-38
参考文献  38-44
附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文  44

基于免疫反应的高灵敏检测方法的建立

内容摘要

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