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鼻咽癌细胞肝转移亚群的筛选及基因表达谱分析

作　者: 韩春
导　师: 姚开泰
学　校: 第一军医大学
专　业: 病理与病理生理学
关键词: 鼻咽癌细胞肝转移基因芯片基因表达谱可视化动物模型
分类号: R739.63
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 21次
引　用: 1次
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内容摘要

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我国南方及东南亚地区常见的恶性肿瘤之一，严重危害着我国人民的健康。研究表明，鼻咽癌在发病机制方面与以下三个因素混合作用有关，即EB病毒的感染、环境致癌物以及遗传特质有关。临床上鼻咽癌大部分表现为低分化鳞癌，这种组织学特性使得鼻咽癌成为头颈部恶性肿瘤中远处转移率最高的肿瘤之一，多数病人早期就诊时就己伴有颈部淋巴结转移。晚期常见的骨转移和肝转移，是导致鼻咽癌患者死亡的主要原因。目前放射治疗是鼻咽癌的主要治疗手段，但是鼻咽癌患者的五年生存率仍低于60％，尸检结果显示有相当多的患者是死于未能诊断的肝转移。因此，建立鼻咽癌细胞肝转移亚群、探讨鼻咽癌肝转移的分子机制、建立可视化的鼻咽癌肝转移动物模型，对了解鼻咽癌肝转移的发展规律、寻找针对性治疗的治疗方法以及药物筛选等都将具有重要意义。肿瘤并不是一个均一的整体，是由各种不同转移潜能的细胞亚群构成的。肿瘤的转移是一个复杂的过程，转移的发生发展是宿主因子与恶性肿瘤细胞内在的特性相互作用的结果，是一个高选择性的过程，只有具有转移潜能的细胞亚群才能发生转移。肿瘤的定向转移是指，特定的肿瘤能够向特定的器官转移，是转移的肿瘤细胞与特定的器官微环境相互作用的结果。根据肿瘤转移的这一特性，有不少研究人员实验性的施加选择压力，分离出适宜特定器官微环境的肿瘤转移亚群，为研究肿瘤的定向转移提供更为纯净的研究对象。基因芯片（Gene Chip）技术是基于核酸探针互补杂交的原理而开发的一种检测基因表达水平的新技术。它具有灵敏度高、检测量大等优点，可同时检测成千上万个基因的表达情况或平行对比这些基因在不同样本中的表达，被认为是一种高通量检测基因表达水平的方法。因此，基因芯片技术可以成为探讨肿瘤转移的分子机制的主要手段。肿瘤细胞原位移植技术的出现，极大的推动了肿瘤动物模型的发展。将人类肿瘤组织或肿瘤细胞原位种植到免疫缺陷的动物体内，能够很好的模拟肿瘤在体内的生长、侵袭、转移过程，复制出与患者十分接近的临床特征，为研究肿瘤的发生发展、转移以及开展实验性的治疗干预，提供了良好的研究对象。近年来新兴的肿瘤分子成像技术，使人们能够在活体动物体内观察肿瘤的侵袭转移过程，提高人们对微小肿瘤和肿瘤微转移的认识。绿色荧光蛋白（green fluorescentprotein，GFP）广泛应用于可视化动物模型的研究，使得人们可以在活体状态下观察肿瘤的演进规律，极大地推动了肿瘤的早期生长、发展规律的研究，有效的弥补了人体肿瘤仅能通过活检、手术标本和尸检等进行分析的不足。本实验通过对已标记GFP的人鼻咽癌高转移细胞株5-8F-EGFP进行裸鼠体内连续传代，人为地施加选择压力，成功的建立了人鼻咽癌细胞肝转移亚群5-8F-H3B-EGFP。通过体内体外实验证明其转移能力明显高于母系，并且有明显的肝转移倾向。我们利用基因芯片技术比较了两株细胞5-8F-EGFP和5-8F-H3B-EGFP的基因表达谱差异（每株细胞重复3次），通过统计学分析，获得了337个表达差异两倍以上的基因。对这281个差异表达基因进行生物学功能分类、文献调研以及基因功能分析，找到了16个与肿瘤肝转移相关的基因。通过聚类分析发现，这16个基因能够很好的区分人鼻咽癌高转移细胞株5-8F-EGFP和人鼻咽癌细胞肝转移亚群5-8F-H3B-EGFP。现简述如下：一．利用裸鼠脾脏注射人鼻咽癌高转移细胞株5-8F-EGFP，获得鼻咽癌肝转移灶，取肝转移瘤组织进行体外扩增培养后，再注射至裸鼠脾脏。经过3代的体内筛选，获得了肝转移率高的人鼻咽癌细胞肝转移亚系5-8F-H3B-EGFP。通过运动实验、侵袭实验、同质黏附实验、异质黏附实验等体外实验将两株细胞进行比较，发现人鼻咽癌细胞肝转移亚群5-8F-H3B-EGFP的运动性、侵袭性均比母系5-8F-EGFP强，5-8F-H3B-EGFP的同质黏附降低，异质黏附增高，这些都证明了5-8F-H3B-EGFP具有比其母系更强的恶性表型。体内实验结果显不5-8F-H3B-EGFP具有明显的向脏转移的倾向。借助肿瘤细胞表达EGFP的特点，我们利用整体荧光成像系统LT-9MACIMSYSPLUS观察肿瘤细胞形成肝转移灶的时间和数量，发现5-8F-EGFP形成肝转移灶的时间长数量少且伴随有大量的腹腔转移灶，肝转移率仅为20％；而5-8F-H3B-EGFP形成肝转移灶的时间短、数量多且未见腹腔其它脏器转移灶，肝转移率可达到100％。采用PCR及Southern Blot对体外扩增培养的人鼻咽癌细胞肝转移亚系5-8F-H3B-EGFP进行人Alu片段检测，结果均为阳性，证实了5-8F-H3B-EGFP是人源性的肿瘤细胞而非裸小鼠的自发肿瘤。将5-8F-H3B-EGFP形成的肝转移瘤进行病理切片检查及免疫组化染色，证明为低分化鳞状细胞癌。以上结果显示，已筛选出人鼻咽癌细胞肝转移亚群5-8F-H3B-EGFP。二．用TRIzol分别提取人鼻咽癌高转移细胞株5-8F-EGFP和人鼻咽癌细胞肝转移亚群5-8F-H3B-EGFP的总RNA，逆转录合成cDNA，然后在体外转录合成cRNA同时标记荧光，纯化后与Affymetrix公司生产的Human Genome U133A₂.0芯片（代表18，400个已知功能基因）杂交，每株细胞重复3次。再利用该公司配套的“基因芯片检测工作站”对芯片进行扫描，并用GCOS 1.2软件对杂交信号强度进行初步分析，数据均一化后，得到两株细胞18400个基因的表达谱。用Gene Spring v7.2软件进行Welch t-test得到两株细胞差异表达的基因5010个，其中表达差异在两倍以上的基因有337个。这337个基因中，有90个在人鼻咽癌细胞肝转移亚系5-8F-H3B-EGFP表达是上调的，如白介素1-α（IL1A）、白介素1-β（IL1B）、血管内皮生长因子C（VEGFC）、前列腺素环氧合酶2（PTGS2）等，247个表达是下调的，如过氧化氢酶（CAT）、N-myc下游调控基因1（NDRG1）等。同时利用MILANO软件进行文献调研，找到了16个有文献报道与肝转移有关的基因。基于3767个基因和281个基因的差异表达谱，分别用Gene Spring V7.2软件进行聚类分析，发现二者聚类结果一致，能够很好的区分人鼻咽癌细胞肝转移亚群5-8F-H3B-EGFP和人鼻咽癌高转移细胞株5-8F-EGFP。再利用16个与肝转移相关的基因进行聚类分析，发现仍然能够很好的区分两株细胞。本实验结果表明，鼻咽癌肝转移的过程中有多个基因的表达水平发生了变化，其中16个与肝转移相关的基因可能在鼻咽癌肝转移的分子机制中起主要作用。人鼻咽癌细胞肝转移亚系5-8F-H3B-EGFP的建立、以及5-8F-EGFP和5-8F-H3B-EGFP差异基因表达谱的建立为我们从分子水平和动物整体水平探讨鼻咽癌生长、发展以及向肝脏转移的规律，寻找针对性治疗鼻咽癌肝转移的方法都具有重要意义。

全文目录

中文摘要  3-7
英文摘要  7-11
前言  11-17
第一部分鼻咽癌细胞肝转移亚株的建立  17-31
  一实验材料  17-18
  二实验方法  18-23
  三结果  23-29
  四小结  29-31
第二部分可视化人鼻咽癌动物模型的建立  31-59
  一实验材料  31-32
  二实验方法  32-39
  三结果  39-58
  四小结  58-59
全文讨论  59-69
结论  69-70
参考文献  70-77
附录  77-78
致谢  78-79

鼻咽癌细胞肝转移亚群的筛选及基因表达谱分析

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