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诺西肽高产菌种的选育与提取工艺的研究

作　者: 楼双凤
导　师: 何建勇
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 诺西肽菌种选育理性化筛选分离纯化生物合成
分类号: TQ464.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
下　载: 35次
引　用: 2次
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内容摘要

本论文以诺西肽产生菌-活跃链霉菌Streptomyces actuosus A01为出发菌株，对菌种的选育、产物的提取纯化方法及生物合成与代谢调控的机理进行了研究。首先对出发菌株进行了自然分离，获得了产量较高、生产性能稳定的菌株D-45，发酵单位为2100 ug／ml。对菌株D-45进行了几种不同诱变剂和不同剂量的考察，确定UV 90s是比较合适的诱变条件。在考察诺西肽固体发酵与摇瓶液体发酵相关性的基础上，采用琼脂块固体发酵法代替摇瓶液体发酵法筛选诺西肽高产菌株，显著提高了筛选效率。其次，本论文建立了半胱氨酸、甲胺、蛋氨酸、自身产物耐受的理性化筛选模型，耐受结果表明：由耐受半胱氨酸或耐受甲胺得到菌株中，高产菌株筛得的几率较高，并由此获得了菌株C₁-11（发酵单位为2583ug／ml）、S4-20（发酵单位为2499ug／ml）。将这三种耐受模型进行组合，经筛选得到了同时耐受Met、甲胺和Cys的高产突变菌株MSC₁-72，该菌株发酵单位高，生产性能稳定，发酵单位达到2961ug／ml。此外，本论文建立了由发酵液分离纯化诺西肽的提取工艺。首次采用了MN-200大孔吸附树脂提取诺西肽，并对诺西肽的结晶工艺条件进行了研究，确定了合适的结晶工艺条件。应用本论文建立的诺西肽分离提取工艺，使产品的总收率达到53％，成品纯度显著提高，成品毫克效价达到852ug／mg。此外还建立了实验室制备诺西肽预混剂的工艺过程，并参照兽药标准对样品进行了检测。本论文还探讨了诺西肽生物合成的前体物一丝氨酸、半胱氨酸来源的可能途径，实验结果表明：参与诺西肽生物合成的丝氨酸可能是由葡萄糖代谢过程中的3-磷酸甘油酸合成而来。

全文目录

中文摘要  10-11
英文摘要  11-13
前言  13-26
  1.1 诺西肽产生菌  14-15
    1.1.1 诺西肽产生菌的发现  14
    1.1.2 产生菌的特征  14-15
  1.2 诺西肽的化学结构和理化性质  15
  1.3 诺西肽的抗菌作用机制  15-16
  1.4 诺西肽的生物合成  16-17
  1.5 抗性和生物合成基因  17-19
  1.6 诺西肽的检测方法  19-21
  1.7 诺西肽的菌种选育  21-23
  1.8 诺西肽提取工艺的研究  23-25
  1.9 诺西肽的国内外研究进展  25-26
实验材料与方法  26-35
  2.1 实验材料  26-28
    2.1.1 菌种  26-27
    2.1.2 培养基  27
    2.1.3 溶液  27
    2.1.4 试剂  27-28
    2.1.5 仪器  28
  2.2 实验方法  28-35
    2.2.1 诺西肽产生菌的菌种选育  28-31
    2.2.2 诺西肽的含量测定  31-32
    2.2.3 代谢参数的测定  32-33
    2.2.4 树脂的处理  33
    2.2.5 诺西肽预混剂的测定  33-35
实验结果  35-75
  Ⅰ.诺西肽高产菌株选育的研究  35-55
    3.1.1 琼脂块固体发酵筛选法的建立  35-37
    3.1.2 出发菌株的确定  37-38
    3.1.3 诱变剂及菌株初始状态的选择  38-44
    3.1.4 理性化筛选模型的建立  44-50
    3.1.5 高产菌株的选育系谱  50
    3.1.6 高产菌株特性的考察  50-55
  Ⅱ 前体与抑制剂对诺西肽生物合成的影响  55-62
    3.2.1 前体对诺西肽生物合成的影响  55-57
    3.2.2 抑制剂对诺西肽生物合成的影响  57-58
    3.2.3 诺西肽生物合成前体Ser生源学的研究  58-62
  Ⅲ 诺西肽分离纯化工艺的研究  62-75
    3.3.1 诺西肽提取工艺的研究  62-75
      3.3.1.1 溶剂提取法提取诺西肽工艺的研究  62-64
      3.3.1.2 大孔吸附树脂法提取诺西肽工艺的研究  64-69
      3.3.1.3 样品的重结晶  69
      3.3.1.4 成品质量分析  69-72
      3.3.1.5 诺西肽总的提取精制流程  72
      3.3.1.6 诺西肽预混剂的质量考察  72-75
结论  75-76
讨论  76-81
参考文献  81-85
致谢  85

诺西肽高产菌种的选育与提取工艺的研究

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