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粘毛黄芩CHS基因植物表达载体的构建及其在烟草中的功能验证

作　者: 饶灿
导　师: 孙敏
学　校: 西南大学
专　业: 植物学
关键词: 粘毛黄芩查尔酮合成酶转基因烟草总黄酮芦丁
分类号: S572
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

粘毛黄芩(Scutellaria viscidula Bunge)的干燥根是我国常用的中药材之一,其主要的有效成分黄岑苷为黄酮类化合物。目前市场上的黄芩苷供不应求,急需提高它的产量。查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)是黄酮类化合物生物合成的第一个关键酶,在黄酮类化合物合成代谢中有着极其重要的作用。由于近年米植物基因工程的应用蓬勃发展,因而通过CHS基因工程提高粘毛黄芩中黄岑苷的含量具有重大的实际意义和广泛的应用前景。本研究是将粘毛黄芩止反义CHS基因构建到植物表达载体pCAMBIA1304+上,得到CHS基因正反义植物表达载体,然后通过遗传转化烟草米验证CHS基因在黄酮类化合物生物合成中的作用。为获得高产黄岑苷的转CHS基因粘毛黄芩植株奠定基础。研究内容如下1.CHS基因止反义植物表达载体的构建PCR扩增得到带酶切位点BlgⅡ和BstEⅡ的正义CHS基因schs和反义CHS基因achs,回收片段与pMD18-T连接,得到正反义克隆载体pMD18-schs和pMD18-achs。用BlgII和BstEII双酶切pMD18-schs, pMD18-achs质粒及表达载体质粒pCAMBIA1304+,胶回收,将正反义CHS基因片段利载体大片段分别进行连接,建成正反义中间表达载体pCAMBIA1304+-schs和pCAMBIA1304+-achs。采用冻融法将pCAMBIA1304+-schs和pCAMBIA1304+-achs分别导入农杆菌LBA4404。2.农杆菌LBA4404介导的CHS基因转化烟草及分子检测取烟草幼嫩无菌叶片,剪成约0.5 cm×0.5cm的小方块,放入制备好的LBA4404菌液中,浸泡5～8min。用无菌滤纸上吸干多余菌液,放在共培养基(MS+1.0mg／L6-BA+0.1mg/LNAA)上暗培养48h。然后转到选择生芽培养基(MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg／L NAA+50mg/LHyg+300mg／L Cef)上进行脱菌选择培养,经过20d左右的光照培养,叶片开始分化出抗性芽。待不定芽长到2～3cm,将其切下放到选择生根培养基(MS+0.1mg／L NAA+25mg／L Hyg+300mg／L Cef)上进行进一步的抗性筛选和生根培养,7天后开始长出不定根。再过二至三周,烟草根系发达,成苗。结果获得转化烟草41株,其中转pCAMBIA1304+-schs(正义)烟草20株,转pCAMBIA1304+-achs(反义)烟草13株,转pCAMBIA1304+(空载体)烟草8株。在转基因烟草植株有3～4片叶时,进行GUS组织化学染色,检测结果为阳性的植株移栽至温室。对GUS检测为阳性且生长较好的转基因烟草植株进行PCR检测,得到5株阳性正义转基因植株,6株阳性反义转基因植株,3株阳性转空载体植株。选取PCR检测为阳性且长势较一致的转基因植株进行RT-PCR检测,与对照(未转化的野生型植株WT和转空载体植株P3)相比,正义转基因植株CS3、CS4和CS6的cDNA都能扩增出1170 bp大小的目的片段ochs,而反义转基因植株CA2、CA4和CA6的cDNA均完全不能扩增出¨目的片段ochs。说明外源止义CHS基因schs在正义转基因植株中已转录为nRNA,使烟草中CHS基因超量表达；而整合到反义转基因烟草基因组的反义CHS基因achs,抑制了烟草CHS基因的表达。3.转基因烟草总黄酮和芦丁含量的测定以分子检测为阳性的转基因烟草和未转化的野生型烟草(对照)为材料,用紫外分光光度法测定其总黄酮含量,HPLC法测定其芦丁含量。结果显示,转空载体植株与对照的总黄酮和芦丁含量均相近；正义转基因植株中总黄酮含量都高于对照植株,其中CS4的总黄酮含量最高,比对照提高了4mg／g DW左右,与对照相比,CS4的芦丁含量也显著增加：反义转基因植株的总黄酮含量均低于对照植株,其中CA2的总黄酮含量最低,比对照降低了约6mg／gDW,与对照相比,CA2中的芦丁含量也明显降低。说明,CHS基因的表达量直接影响黄酮类化合物的合成量,它是黄酮类化合物生物合成代谢调控的一个重要作用靶点

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摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
第1章文献综述  10-32
  1.1 黄酮类化合物的研究概况  10-24
    1.1.1 黄酮类化合物的结构与种类  10-11
    1.1.2 黄酮类化合物的生物活性  11-15
    1.1.3 黄酮类化合物的生物合成  15-24
  1.2 CHS基因的研究进展  24-28
    1.2.1 CHS基因的分离与结构  24-25
    1.2.2 CHS反应机理  25
    1.2.3 CHS基因的表达特性  25-26
    1.2.4 CHS基因的进化  26
    1.2.5 CHS在基因工程中的应用  26-28
  1.3 黄芩的研究进展  28-32
    1.3.1 黄芩的化学成分及药理作用  28-29
    1.3.2 生物技术在植物黄芩中的应用  29-30
    1.3.3 今后研究方向展望  30-32
第2章引言  32-34
  2.1 研究目的与意义  32
  2.2 研究内容  32-34
第3章粘毛黄芩CHS基因正反义植物表达载体的构建  34-50
  3.1 实验材料  34-35
    3.1.1 菌种和质粒  34
    3.1.2 试剂  34-35
    3.1.3 培养基  35
    3.1.4 PCR扩增引物序列  35
    3.1.5 主要仪器设备  35
  3.2 实验方法  35-41
    3.2.1 正反义中间表达载体的构建  35-39
    3.2.2 正反义中间表达载体导入农杆菌LBA4404  39-40
    3.2.3 CHS基因正反义植物表达载体的构建路线  40-41
  3.3 实验结果与分析  41-48
    3.3.1 正反义目的基因的PCR扩增  41
    3.3.2 pMD18-schs和pMD18-achs的获得及chs的生物信息学分析  41-44
    3.3.3 pMD18-schs、pMD18-achs质粒和pCAMBIAl3O4~+质粒的双酶切  44-45
    3.3.4 pCAMBIAl3O~4+-schs和pCAMBIA13O4~+-achs的获得  45-47
    3.3.5 正反义中间表达载体导入农杆菌LBA4404  47-48
  3.4 讨论  48-50
第4章粘毛黄芩CHS基因的遗传转化与分子检测  50-64
  4.1 实验材料  50-52
    4.1.1 植物材料  50
    4.1.2 生化试剂  50
    4.1.3 培养基  50-51
    4.1.4 主要试剂的配制  51-52
    4.1.5 主要仪器设备  52
  4.2 实验方法  52-56
    4.2.1 烟草的遗传转化  52-53
    4.2.2 转基因烟草的分子检测  53-56
  4.3 实验结果与分析  56-61
    4.3.1 转基因烟草的获得  56-58
    4.3.2 转基因烟草的GUS组织化学分析  58-59
    4.3.3 转基因烟草的PCR检测  59-60
    4.3.4 转基因烟草的RT-PCR检测  60-61
  4.4 讨论  61-64
第5章转基因烟草总黄酮和芦丁含量的测定  64-70
  5.1 实验材料  64
    5.1.1 植物材料  64
    5.1.2 试剂  64
    5.1.3 主要仪器设备  64
  5.2 实验方法  64-65
    5.2.1 总黄酮的提取  64
    5.2.2 总黄酮含量的测定  64-65
    5.2.3 芦丁含量的测定  65
  5.3 实验结果与分析  65-69
    5.3.1 总黄酮含量的测定  65-67
    5.3.2 芦丁含量的测定  67-69
  5.4 讨论  69-70
第6章结论与建议  70-72
  6.1 CHS基因正反义植物表达载体的构建  70
  6.2 根癌农杆菌LBA4404介导的CHS基因转化烟草及分子检测  70
  6.3 转基因烟草总黄酮和芦丁含量的测定  70
  6.4 下一步工作建议  70-72
参考文献  72-82
附录  82-84
致谢  84-86
在学期间所发表的文章  86

粘毛黄芩CHS基因植物表达载体的构建及其在烟草中的功能验证

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