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转基因创建矮牵牛、烟草早花种质资源的研究

作　者: 吕海燕
导　师: 胡惠蓉；宁国贵
学　校: 华中农业大学
专　业: 园林植物与观赏园艺
关键词: 转基因烟草转基因矮牵牛花期二次转化早花种质资源
分类号: S572
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

当前,植物花发育机制已成为植物分子生物学研究的热点之一。烟草、矮牵牛作为研究花发育的模式植物,同时矮牵牛又是一种在园林中广泛应用的花卉植物,对其开花转换的研究以及通过转基因获得变异植株,无论对植物花发育机制研究还是植物育种均具有重要的意义。本试验选用野生型矮牵牛、烟草及其不同转基因突变株系为材料,以叶盘为外植体,将NT、PaFT基因通过根癌农杆菌EHA105介导,进行遗传转化,获得转基因植株,并从形态、解剖和分子等水平,分析它们的异源表达对转基因植物生长发育的影响,为NT、PaFT基因功能及后期的调控机理研究奠定基础,同时创造更多新的早花烟草、矮牵牛种质资源。主要结果如下:1.通过农杆菌介导的遗传转化获得花期显著提前的NT转基因烟草和矮牵牛突变株。与对照相比,转基因植株株型矮小,开花转换时叶数显著减少,分枝数增多,且每一个分枝都能发育转变成花序枝而开花结实。另外,转基因植株茎细,质感硬,石蜡切片初步显示其木质化程度比对照高。2.以转NT基因获得的早花烟草的叶片为外植体,确定了其作为遗传转化受体系统的二次转化选择压力。结果表明,30 mg/L的潮霉素即可导致早花烟草叶片失去分化能力,还可导致试管苗失去分化不定根的能力。300 mg/L的头孢霉素做为抑菌剂,对不定芽和不定根的分化能力均影响不大。3.以转NT基因获得的含nptⅡ选择标记基因的早花烟草叶片为外植体,摸索了其根癌农杆菌介导的二次遗传转化体系。通过导入含hpt选择标记基因的GUS报告基因,经检测得到了GUS稳定表达的抗性芽。与烟草单基因转化相比,二次转化耗时长,且转化率相对较低。4.以课题组前期获得的转单基因突变株白花烟草和重瓣烟草为转化受体,二次转化PaFT基因,获得了部分早花白花烟草和早花重瓣烟草突变株。PCR检测及形态分析鉴定表明PaFT基因已成功导入上述材料当中。另外,重瓣烟草经二次转化,大部分抗性植株重瓣性状回复,出现早花单瓣表型。

全文目录

摘要  8-9
Abstract  9-11
缩略词表  11-12
1 前言  12-28
  1.1 高等植物花发育及花色研究  12-22
    1.1.1 花发育的基因调控  12-14
    1.1.2 开花时间相关基因的结构特征与作用机制  14-18
      1.1.2.1 花分生组织特异基因  14-15
      1.1.2.2 花序分生组织特异基因  15
      1.1.2.3 开花整合基因  15-18
    1.1.3 花型基因工程研究进展  18-20
    1.1.4 花色基因工程研究进展  20-22
      1.1.4.1 花色基因工程  20
      1.1.4.2 MYB类转录因子家族  20-22
  1.2 多基因转化研究进展  22-27
    1.2.1 杂交方法  23
    1.2.2 重复转化法  23-24
    1.2.3 共转化法  24-25
    1.2.4 叶绿体介导的多基因转化技术  25-26
    1.2.5 内部核糖体介导的多基因转化技术  26-27
  1.3 本研究的目的及意义  27-28
2 NT基因转化烟草的研究  28-41
  2.1 引言  28
  2.2 材料与方法  28-31
    2.2.1 试验材料  28-29
    2.2.2 试验方法  29-31
      2.2.2.1 NT基因的保存与活化  29
      2.2.2.2 烟草的遗传转化  29
      2.2.2.3 转基因烟草植株的田间种植  29
      2.2.2.4 转基因烟草植株的PCR检测  29-31
      2.2.2.5 转基因烟草植株主要植物学性状的观测  31
      2.2.2.6 转基因烟草植株后代筛选及性状观测  31
      2.2.2.7 转基因烟草茎的显微结构观察  31
  2.3 结果与分析  31-39
    2.3.1 转基因烟草植株的PCR检测  32
    2.3.2 烟草植株花期及主要植物学性状  32-35
      2.3.2.1 转基因植株形态学观测  32-34
      2.3.2.2 转基因植株开花期观测  34-35
    2.3.3 转基因烟草茎段的显微结构变化与分析  35-36
    2.3.4 转基因烟草植株T_1代筛选  36-37
    2.3.5 转基因烟草T_1代植株性状  37-38
    2.3.6 转基因烟草T_2代的性状观测  38-39
  2.4 讨论  39-41
    2.4.1 NT基因对烟草花期的影响  39
    2.4.2 转基因植株的形态变化  39
    2.4.3 NT基因与木质化程度分析  39
    2.4.4 外源基因的转录水平  39-41
3 NT基因转化矮牵牛的研究  41-49
  3.1 引言  41
  3.2 材料与方法  41-43
    3.2.1 试验材料  41
    3.2.2 试验方法  41-43
      3.2.2.1 农杆菌叶盘转化法介导的NT基因的遗传转化  41-42
      3.2.2.2 转基因矮牵牛的移栽  42
      3.2.2.3 转基因矮牵牛的PCR检测  42-43
      3.2.2.4 转基因矮牵牛植株主要植物学性状观测  43
      3.2.2.5 转基因矮牵牛茎及花的显微结构观察  43
      3.2.2.6 转基因矮牵牛T_1代观测  43
  3.3 结果与分析  43-48
    3.3.1 转基因矮牵牛植株的PCR检测  43-44
    3.3.2 转基因矮牵牛植株花期及主要植物学性状  44-45
    3.3.3 转基因矮牵牛植株茎及花的显微结构观察  45
    3.3.4 转基因矮牵牛T_1代植株性状及遗传规律分析  45-48
  3.4 讨论  48-49
    3.4.1 NT基因对矮牵牛结实及后代生活力的影响  48
    3.4.2 NT基因对矮牵牛花期及株型的影响  48
    3.4.3 外源基因对植株着花部位的影响  48-49
4 烟草多基因转化研究  49-62
  4.1 引言  49
  4.2 材料与方法  49-52
    4.2.1 试验材料  49-51
      4.2.1.1 植物材料  49-50
      4.2.1.2 转化载体及培养  50
      4.2.1.3 试剂及配方  50-51
    4.2.2 试验方法  51-52
      4.2.2.1 潮霉素最佳选择压力的确定  51
      4.2.2.2 二次转化报告基因及检测  51-52
      4.2.2.3 PaFT基因二次转化白花烟草  52
      4.2.2.4 PaFT基因二次转化重瓣烟草  52
      4.2.2.5 二次转化植株移栽  52
      4.2.2.6 二次转化植株的PCR检测  52
      4.2.2.7 二次转化植株主要植物学性状的观测  52
  4.3 结果与分析  52-59
    4.3.1 潮霉素最佳选择压力的确定  52-55
      4.3.1.1 潮霉素对叶片再生选择压力的试验  52-54
      4.3.1.2 潮霉素对植株生根选择压力的试验  54-55
    4.3.2 报告基因二次转化结果  55-56
    4.3.3 二次转化烟草植株的PCR检测  56-57
    4.3.4 转化植株花期及主要植物学性状  57-59
      4.3.4.1 PaFT基因二次转化白花烟草结果  57-58
      4.3.4.2 PaFT基因二次转化重瓣烟草结果  58-59
  4.4 讨论  59-62
    4.4.1 烟草多基因转化  59-60
    4.4.2 烟草二次转化  60
    4.4.3 筛选标记的剔除  60
    4.4.4 PaFT对白花烟草、重瓣烟草花期及株型的影响  60-61
    4.4.5 转化植株的鉴定  61-62
5 结论  62-63
参考文献  63-77
致谢  77

转基因创建矮牵牛、烟草早花种质资源的研究

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