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小球藻CS-01的分离鉴定及自养与异养条件下脂质合成相关基因的表达差异研究

作　者: 王润民
导　师: 夏金兰
学　校: 中南大学
专　业: 生物工程
关键词: 生物柴油小球藻脂质光合自养异养实时定量-PCR
分类号: TE667
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

石化燃料等不可再生形式的能源面临日益枯竭的现况,加之世界能源需求的飞速增长,使得新能源的开发备受关注。开发与利用可再生、可持续利用、环境友好的新型的替代能源是人类社会发展的必然趋势。生物柴油是从生物质中提取和转化得到的一种新的能源形式,应用前景非常广阔。目前限制其广泛应用的因素主要是原料来源问题。微藻作为生物柴油的原料在最近几年成为了研究的热点,因为相对传统的植物来源,微藻具有生长速度快、脂质含量高、不占用耕地、综合利用价值高等优势。因此,本课题就产脂质微藻藻株的筛选、分离鉴定、培养方法以及不同培养方式下的脂质合成相关基因的表达差异等方面开展研究,为后续的研究提供藻株,以及为阐释微藻合成脂质过程中基因调控机理提供数据基础,为基因工程微藻的构建奠定一定的基础。具体内容包括以下两个方面：(1)产脂质微藻藻株的分离鉴定与生理生化表征。从内蒙古包头市取得的淡水水体中筛选得到一株新的绿藻藻株,经鉴定为一株小球藻,GeneBank 18S rRNA提交序列号为：GQ122327,命名为Chlorella sorokiniana CS-01。该小球藻菌株生长速度较快,非限制营养培养条件下脂质含量为14%-20%,在特殊培养条件下脂质含量可达到60%左右。该株微藻特点是：pH和温度适应范围较广,耐碱性环境,pH6-11和20℃-35℃之间均能很好地生长,最适pH和温度分别是9.0和30℃；控制氮源条件下和异养培养模式下能大幅度提高该微藻脂质含量。该藻株已经提交中国国家典型培养物保藏中心保藏(保藏号：CCTCC M209220),并且正在申请了相关专利(专利申请号：200910252395.3)。(2)小球藻Chlorella sorokiniana CS-01在光合自养和异养条件下的脂质合成相关基因的表达差异研究小球藻CS-01可以利用葡萄糖在避光条件下进行异养生长,并且生长周期大大缩短(7天),生物量和脂质含量都有大幅度提高,分别是光合自养条件下的8倍左右和2.5倍左右,细胞的其它生化组成如糖和蛋白质也有很大变化。本课题选择了三个与脂质合成和生长相关的基因：rbcL、accD、accl以18S rDNA基因为内参,通过Real-Time PCR的方法分析了在自养和异养条件下,小球藻CS-01在指数生长期和稳定期三个基因的表达差异情况。结果表明,葡萄糖的加入改变了微藻的代谢途径,调节了accD、accl和rbcL等与小球藻CS-01生长、脂质合成的相关基因的表达。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
符号说明  8-9
目录  9-11
第一章绪论  11-28
  1.1 生物柴油  11-15
    1.1.1 生物柴油的生产原理  11-12
    1.1.2 生物柴油的优势  12-13
    1.1.3 国内外生物柴油的开发利用现状  13-15
  1.2 微藻生物柴油  15-24
    1.2.1 微藻制备生物柴油的优势  16-18
    1.2.2 微藻生物质的生产  18-20
    1.2.3 微藻生物柴油国内外相关的研究进展  20-22
    1.2.4 微藻的培养条件对微藻油脂积累的影响  22-24
  1.3 微藻生长与脂质合成相关基因的研究  24-26
    1.3.1 rbcL基因与核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶  24-26
    1.3.2 微藻脂肪酸代谢与乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACCase)  26
  1.4 微藻生物柴油开发利用目前存在的问题与热门研究方向  26-27
    1.4.1 目前存在的问题  26-27
    1.4.2 目前研究的热门方向  27
  1.5 本课题研究的目的和意义  27-28
第二章小球藻CS-01的分离、鉴定和表征  28-38
  2.1 实验材料  28-30
    2.1.1 藻种筛选水样来源  28
    2.1.2 培养基组成  28
    2.1.3 试剂与仪器  28-30
  2.2 实验方法  30-32
    2.2.1 培养条件和菌株的分离纯化方法  30
    2.1.2 菌株的形态特征及生理生化检测  30-31
    2.1.3 微藻脂质含量的测定  31
    2.1.4 基因组DNA的提取和18S rDNA序列分析  31-32
  2.3 结果与讨论  32-37
    2.3.1 藻株CS-01的形态特征  32
    2.3.2 温度对藻株CS-01生长和脂质的影响  32-34
    2.3.3 pH对藻株CS-01生长和脂质的影响  34-35
    2.3.4 氮源种类对藻株CS-01生长和脂质的影响  35-36
    2.3.5 藻株CS-01的18S rDNA序列分析  36-37
  2.4 本章小结  37-38
第三章小球藻Chlorella sorokiniana CS-01的异养培养研究  38-43
  3.1 实验材料  38-39
    3.1.1 菌种和培养基  38
    3.1.2 主要仪器设备  38-39
  3.2 实验方法  39
    3.2.1 不同碳源利用情况  39
    3.2.2 最佳碳源浓度  39
    3.2.3 生长测定  39
    3.2.4 脂质含量测定  39
  3.3 结果与讨论  39-41
    3.3.1 小球藻Chlorella sorokiniana CS-01对不同碳源的利用情况  39-40
    3.3.2 葡萄糖浓度对小球藻CS-01的生长和脂质含量的影响  40-41
  3.4 本章小结  41-43
第四章小球藻Chlorella sorokiniana CS-01在光合自养和异养培养条件下的脂质积累相关基因的表达差异研究  43-59
  4.1 实验材料  43-44
    4.1.1 菌种和培养基  43
    4.1.2 主要试剂与仪器  43-44
  4.2 实验方法  44-52
    4.2.1 光合自养与异养小球藻生长的测定  44-45
    4.2.2 脂质含量测定  45
    4.2.3 可溶性蛋白质含量测定  45-46
    4.2.4 细胞总糖含量测定  46-47
    4.2.5 总RNA的提取和纯化  47-49
    4.2.6 反转录cDNA合成  49
    4.2.7 PCR引物设计及标准曲线的制作  49-50
    4.2.8 Real-time PCR检测  50-52
  4.3 结果与讨论  52-57
    4.3.1 小球藻CS-01在不同培养模式下不同生长时期生长及生化组成  52-53
    4.3.2 引物特异性测定  53
    4.3.3 总RNA质量分析  53-54
    4.3.4 光合自养与异养培养条件下脂质合成相关基因的表达差异分析  54-57
  4.4 本章小结  57-59
第五章全文结论  59-60
参考文献  60-67
致谢  67-68
攻读学位期间的主要研究成果  68

小球藻CS-01的分离鉴定及自养与异养条件下脂质合成相关基因的表达差异研究

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