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富自体CGF纤维蛋白膜对人牙龈成纤维细胞黏附及增殖的影响

作　者: 张晓
导　师: 董福生；任贵云
学　校: 河北医科大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: CGF纤维蛋白膜 Bio-gide膜牙龈成纤维细胞增殖 MTT
分类号: R781.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

目的：富自体浓缩生长因子（Concentrated Growth Factors, CGF）纤维蛋白为新一代的血液提取物，为自体血经不间断差速离心制备而成的富含多种高浓度生长因子的纤维蛋白，能够促进骨组织及软组织的再生和修复。本研究旨在采用扫描电镜及HE染色，观察体外培养人牙龈成纤维细胞在CGF膜表面的黏附及增殖，为CGF应用于牙周组织重建及其进一步临床应用提供理论依据。方法：1人牙龈成纤维细胞的培养及鉴定切取河北医科大学口腔医院口腔颌面外科门诊阻生牙拔除患者正常牙龈组织，患者年龄18-25岁。组织块培养法原代培养，培养液选用含20%胎牛血清的低糖DMEM，待细胞长至覆盖瓶底的80%时，0.25%胰蛋白酶消化传代。取第2代生长状态良好的人牙龈成纤维细胞，采用鼠抗人波形蛋白（Vimentin）、角蛋白抗体（cytokeratin）进行鉴定。2实验分组及材料准备实验分三组：CGF膜组、Bio-gide膜组及空白组CGF膜制备：9ml Vacuette真空采血管采取患者静脉血，立即置入Medifuge离心机，离心13分钟后，可见采血管中血液分为三层，弃除上层血清，自中间层及底层交界处剪开，压膜模具将留取的中段CGF纤维蛋白层凝胶压制成膜。修剪CGF膜至5×5mm大小，置于无菌生理盐水中备用。Bio-gide膜修剪为5×5mm大小，置于无菌生理盐水备用。3人牙龈成纤维细胞接种培养取生长状态良好的第3代人牙龈成纤维细胞，制备成5×104/ml单细胞悬液，分别接种于CGF膜及Bio-gide膜表面，空白组滴加等量的细胞悬液。加入含20%胎牛血清的低糖DMEM培养液，置于37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中培养，每2天换液一次。4组织学观察接种培养5天，分别取出CGF膜及Bio-gide膜，PBS冲洗，10%福尔马林固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，组织学观察。5扫描电镜观察接种培养5天，分别取出CGF膜及Bio-gide膜，PBS冲洗，2.5%戊二醛固定，脱水，临界点干燥，喷金镀膜，扫描电子显微镜(scanning electronmicroscopy, SEM)观察。6人牙龈成纤维细胞增殖活性MTT检测分别于接种培养2天、5天，酶联免疫标记仪上490nm处测定各组细胞吸光度OD值。每组设8个平行试样，计算各组吸光度均值（以x±s表示）。7统计学分析应用SPSS13.0软件进行统计学分析，应用单因素方差分析比较三组吸光度值，P<0.05有统计学意义。结果：1人牙龈成纤维细胞的培养及鉴定原代培养6天，倒置显微镜下观察：可见细胞自组织块周边生长，细胞为长梭形，胞质向外伸出2~3个突起，胞体丰满，胞浆均匀，胞核圆形或卵圆形，核仁大。12-14天后细胞开始融合，以组织块为中心呈放射状、漩涡状生长。采用第2代人牙龈成纤维细胞进行免疫组织化学染色，人牙龈成纤维细胞抗Vimentin染色阳性，胞浆呈棕黄色着色；抗cytokeratin染色阴性。2组织学观察CGF膜组：表面细胞形态清晰，胞体丰满，核大，核仁深染，向膜深层长入。Bio-gide膜组：表面胞体皱缩，核小，位于膜表层。3扫描电镜观察CGF膜组：表面细胞生长状态良好，叠层状生长，胞体丰满，片状伪足相互连接。Bio-gide膜组：表面细胞分散生长，数量较少，细胞长梭形，胞体小，部分细胞呈扁平状，细小的伪足黏附于纤维间，少部分细胞可见到细胞间连接。4人牙龈成纤维细胞增殖活性MTT检测接种培养2天，各组吸光度均值（以x±s表示）：CGF膜组，0.596±0.049；Bio-gide膜组，0.601±0.035；空白组，0.575±0.014；三组吸光度值无统计学意义(P>0.05)。接种培养5天，三组细胞吸光度均值（以x±s表示）： CGF膜组，0.853±0.031；Bio-gide膜组，0.733±0.027；空白组，0.634±0.013，三组吸光度值之间均有统计学意义(P <0.05)，每两组间均有差异。结论：1CGF纤维蛋白膜有利于人牙龈成纤维细胞的黏附，人牙龈成纤维细胞在其表面生长良好。2CGF纤维蛋白膜能明显促进人牙龈成纤维细胞增殖。3CGF纤维蛋白膜有望成为牙周组织工程重建的支架材料。

全文目录

中文摘要  4-7
ABSTRACT  7-11
前言  11-12
材料与方法  12-17
结果  17-19
附图  19-32
附表  32-33
讨论  33-36
结论  36-37
参考文献  37-39
综述富自体生长因子纤维蛋白生物材料性能及其临床应用  39-49
  参考文献  45-49
致谢  49-50
个人简历  50

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