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人增生性瘢痕与正常皮肤组织MicroRNA差异表达及粉防己碱的干预作用

作　者: 宁璞
导　师: 刘德伍
学　校:
专　业: 外科学
关键词: microRNA 增生性瘢痕 粉防己碱 成纤维细胞 基因表达谱
分类号: R622.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的：观察人增生性瘢痕与正常皮肤组织microRNA差异表达及粉防己碱对人增生性瘢痕成纤维细胞microRNA表达的影响，探讨增生性瘢痕形成机制及粉防己碱在瘢痕防治中的意义。方法：（1）收集增生性瘢痕作为实验组T1，其邻近正常皮肤组织作为对照组C1，采用Trizol法分别抽提总RNA，先用mirVana microRNA分离试剂盒对其进行纯化，然后使用microRNA标记和杂交试剂盒进行荧光标记及芯片杂交，利用Feature Extraction(v10.7)软件对杂交图片进行分析，再用GeneSpring(GX10.0)软件进行数据归一化及差异分析，同时应用实时定量反转录聚合酶链反应（Real-Time PCR）验证microRNA芯片结果的可靠性，并通过生物信息学方法对差异表达明显的microRNAs进行靶基因预测。（2）取人增生性瘢痕组织标本，体外分离培养成纤维细胞，加入浓度为5μg/ml的粉防己碱干预作为实验组T2，并以不含药物的人增生性瘢痕成纤维细胞作为对照组C2。细胞培养48h后，采用microRNA微阵列芯片检测技术进行芯片杂交，并应用实时定量反转录聚合酶链反应（Real-Time PCR）验证microRNA芯片结果的可靠性，通过生物信息学方法对经过验证的microRNAs进行靶基因预测。结果：(1)筛选出在人增生性瘢痕中表达上调的microRNAs92个，表达下调的microRNAs13个。其中显著上调的有hsa-miR-564，hsa-miR-936等；显著下调的有hsa-miR-451，hsa-miR-223，hsa-miR-363，hsa-miR-29b-1*等。其中上调的hsa-miR-21和下调的hsa-miR-451的Real-Time PCR验证结果与检测结果具有较好的一致性。部分microRNAs的靶基因与成纤维细胞生长、胶原形成及细胞的黏附、增殖、凋亡和分化密切相关。(2)筛选出在粉防己碱干预组中表达下调的microRNAs有186个，如：hsa-miR-1246，hsa-miR-10b，hsa-miR-760等；表达上调的microRNAs有7个，如： hsa-miR-27b， hsa-miR-29b-1*，hsa-miR-193a-3p等。Real-Time PCR对其中表达上调的hsa-miR-27b和表达下调的hsa-miR-125b的验证结果与芯片检测结果具有较好的一致性，其靶基因不仅参与细胞增殖、分化、凋亡等多种信号通路，还与胶原形成息息相关。结论：人增生性瘢痕和正常皮肤组织中存在明显的microRNA差异性表达，可能与增生性瘢痕的发生、发展及演化密切相关；粉防己碱对体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞microRNA的表达具有调控作用，可能是其抗瘢痕增生效应的另一重要机制。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-9
中英文缩略词表  9-11
第一部分 增生性瘢痕与正常皮肤组织 microRNA 的差异表达谱研究  11-33
  1 前言  11-12
  2 材料和方法  12-19
    2.1 材料  12-13
      2.1.1 标本来源  12-13
      2.1.2 主要试剂  13
      2.1.3 主要仪器  13
    2.2 方法  13-19
      2.2.1 收集人增生性瘢痕及正常皮肤组织  13-14
      2.2.2 提取组织（T1、C1）中的总 RNA  14
      2.2.3 总 RNA 质量检查  14-15
      2.2.4 总 RNA 的分离纯化  15
      2.2.5 miRNA 的荧光标记和芯片杂交  15-16
      2.2.6 杂交芯片的清洗及扫描  16
      2.2.7 数据处理  16-17
      2.2.8 实时定量 RT-PCR 验证芯片结果  17-18
      2.2.9 预测差异表达明显的 miRNAs 的靶基因  18-19
  3 结果  19-29
    3.1 总 RNA 抽提结果  19
    3.2 芯片扫描结果  19-20
    3.3 筛查结果  20-23
    3.4 实时定量 RT-PCR 验证结果  23-26
    3.5 miRNA 的靶基因预测结果  26-29
  4 讨论  29-32
  5 结论  32-33
第二部分 粉防己碱对人增生性瘢痕成纤维细胞 microRNA 的干预作用  33-54
  1 前言  33-34
  2 材料和方法  34-39
    2.1 材料  34-35
      2.1.1 标本来源  34
      2.1.2 主要试剂  34-35
      2.1.3 主要仪器  35
    2.2 方法  35-39
      2.2.1 人增生性瘢痕成纤维细胞的体外培养  35-36
      2.2.2 加入药物干预  36
      2.2.3 提取总 RNA  36
      2.2.4 总 RNA 质量检查  36-37
      2.2.5 总 RNA 的分离纯化  37
      2.2.6 miRNA 的荧光标记和芯片杂交  37
      2.2.7 杂交芯片的清洗及扫描  37
      2.2.8 数据处理  37-38
      2.2.9 实时定量 RT-PCR 验证芯片结果  38
      2.2.10 预测差异表达明显的 miRNAs 的靶基因  38-39
  3 结果  39-50
    3.1 人增生性瘢痕成纤维细胞形态学观察  39
    3.2 总 RNA 抽提结果  39-40
    3.3 芯片扫描结果  40
    3.4 筛查结果  40-47
    3.5 实时定量 RT-PCR 验证结果  47-50
    3.6 miRNA 的靶基因预测结果  50
  4 讨论  50-52
  5 结论  52-54
全文结论  54-55
致谢  55-56
参考文献  56-60
攻读学位期间的研究成果  60-61
综述  61-70
  参考文献  68-70

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中图分类: > 医药、卫生 > 外科学 > 整形外科学（修复外科学） > 整形手术学 > 皮肤移植
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