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血小板制品细菌污染快速核酸检测方法研究

作　者: 王纪东
导　师: 张娟琨
学　校: 天津科技大学
专　业: 发酵工程
关键词: 血小板细菌污染核酸层析等温扩增快迷检测 16SrDNA
分类号: R446.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

近年来,血小板制品临床需求量不断上升。由于缺少经济、简便、快速的检测方法,血液制品细菌污染已成为了引发输血脓毒血症和致死的主要原因之一。目前最常用的培养检测方法耗时长且对仪器及人员要求高,无法满足血液制品常规细菌筛查的需求。针对上述问题,本研究首先采用通用引物对细菌16S rDNA保守区段进行了扩增,用核酸层析技术对扩增子进行了可视化检测。为了在紧急条件下也能对血小板细菌污染进行检测,我们随后对NEMA (nicking enzyme mediated amplification)核酸等温扩增技术进行了初步探索,并利用该技术对多种细菌污染进行了检测。具体研究内容如下：(1)选用通用引物和通用探针对细菌16S rDNA保守区段进行扩增和标记,并使用核酸层析检测技术(nucleic acid lateral flow dipstick, LFD)完成扩增子的可视化检测。该方法比常规PCR (Polymerase chain reaction)结合琼脂糖凝胶电泳检测灵敏10倍以上。该方法对模拟的多种血小板细菌污染样品的灵敏度分别达至5CFU/mL (肺炎克雷白氏杆菌)、35CFU/mL (铜绿假单胞杆菌)和16.5×104CFU/mL (表皮葡萄球菌)。整个检测过程在2h内完成,相比细菌培养等方法大大缩短了检测时间,使之更适合成为发放时点检测方法。(2)通过独特的引物设计,采用切刻酶介导的等温扩增技术(nicking enzyme mediated amplification, NEMA)扩增蜡样芽孢杆菌16S rDNA,证明其可以扩增至少450bp长度的质粒片断。并通过优化NEMA扩增体系中的缓冲液,反应温度,Mg2+浓度,DMSO浓度等条件提高检测灵敏度100倍,但海藻糖等反应佐剂的使用对反应并无明显影响。(3)设计了针对未知污染菌的通用引物,扩增了多种污染菌的16S rDNA,并对扩增条件进行了优化。最后,我们将该方法应用到缓冲液中真实细菌的检测中。结果显示,通用引物的设计对血小板中多种未知污染菌的检测完全可行,利用四条引物可以保证NEMA扩增的特异性；且核酸层析检测相比琼脂糖凝胶电泳检测具有一定的优越性。在目前优化的反应条件下,该方法对蜡样芽孢杆菌的检测灵敏度为1.4×106CFU/test,而对肺炎克雷伯氏杆菌的检测灵敏度为6.0×107CFU/tes。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-7
目录  7-9
前言  9-21
  1.1 血小板制品细菌污染现状  9-10
  1.2 血小板细菌污染检测方法  10-14
    1.2.1 代谢物检测  10-12
    1.2.2 免疫检测  12-13
    1.2.3 核酸检测  13-14
  1.4 快速核酸检测方法  14-19
    1.4.1 核酸等温扩增技术  14-17
    1.4.2 NEMA等温扩增技术  17-18
    1.4.3 核酸层析技术  18-19
  1.5 本课题的立题依据及研究内容  19-21
    1.5.1 本课题的立题依据  19
    1.5.2 本课题研究的内容  19-21
材料与方法  21-28
  2.1 材料与仪器  21-23
    2.1.1 菌株  21
    2.1.2 主要试剂  21
    2.1.3 主要培养基  21
    2.1.4 主要溶液  21-22
    2.1.5 仪器设备  22
    2.1.6 所用引物  22-23
  2.2 实验方法  23-28
    2.2.1 阳性质粒的构建  23-24
    2.2.2 PCR-LFD检测方法的建立  24-26
    2.2.3 NEMA-LFD检测条件  26-28
结果与讨论  28-45
  3.1 PCR-LFD方法检测血小板细菌污染  28-32
    3.1.1 PCR-LFD检测特异性结果  28
    3.1.2 PCR-LFD检测的灵敏度  28-29
    3.1.3 PCR-LFD检测细菌污染血小板样本的灵敏度  29-32
  3.2 切口酶介导等温扩增方法的建立  32-39
    3.2.1 不同长度片断的引物设计  33-34
    3.2.2 反向引物对扩增反应的影响  34
    3.2.3 NEMA恒温扩增条件优化基础配方  34-39
  3.3 切口酶介导等温扩增方法检测细菌污染  39-45
    3.3.1 NEMA中dNTP/Mg~(2+)与海藻糖浓度优化  39
    3.3.2 NEMA中DMSO浓度的优化  39-40
    3.3.3 NEMA-LFD检测技术通用性结果  40-41
    3.3.4 NEMA-LFD检测技术灵敏度结果  41-45
4 结论  45-46
5 展望  46-47
6 参考文献  47-54
7 论文发表情况  54-55
8 致谢  55

血小板制品细菌污染快速核酸检测方法研究

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