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RNA去甲基化酶FTO抑制剂的筛选及ALKBH5的晶体结构研究

作　者: 周斌
导　师: 柴继杰
学　校: 中国农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: m6A 去甲基化 FTO 抑制剂 ALKBH5
分类号:
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

m6A是真核生物mRNA和IncRNA中含量最为丰富的一种修饰碱基。m6A影响mRNA的剪接、运输、翻译和降解,参与脂肪生成、精子发生、发育、致癌、干细胞再生以及其他生命进程。FTO是第一个通过全基因组关联分析发现与肥胖密切相关的基因,也是目前发现与肥胖相关性最强的易感基因。许多研究报道FTO与心血管疾病,Ⅱ型糖尿病,阿尔茨海默氏病和乳腺癌等多种疾病的发生发展密切相关。FTO基因编码一种20G加氧酶,是第一个被发现的mRNAm6A去甲基化酶。本实验室在早期解析FTO蛋白与3-meT复合物晶体结构(PDB:3LFM)的基础上,进一步开展了对FTO抑制剂的设计合成和活性评价。根据FTO晶体结构,结合分子对接分析和高通量虚拟筛选后,设计了120种FTO抑制剂的备选化合物。首先以3-meT为底物,对120种化合物进行体外抑制FTO去甲基化酶活性的系统筛选,最后筛选得到3种结构独特的化合物,它们对FTO去甲基化酶活性有显著影响,将其命名为C1、C2和C3。通过对这3种化合物的结构比较和构效分析,进一步优化出另外两种化合物：C4和C5。然后分别以含：m6A的ssDNA和ssRNA为底物,对这5种化合物的FTO去甲基化酶活性的抑制作用进行了系统检测。结果发现,这5种化合物对FTO的抑制活性均表现有浓度依赖性,FTO酶活性随化合物的浓度升高而降低。其中C1对FTO抑制活性最高,C2次之,C5最低。以ALKBH2和ALKBH5为靶标检测不同抑制剂靶标酶的选择性。结果表明化合物C1和化合物C2也对ALKBH2去甲基活性有明显抑制,化合物C1对ALKBH5有很强抑制作用。实验表明C1、C3、C4这3种化合物在细胞内也有一定程度的去甲基化酶抑制活性。ALKBH5与FTO均属于AlkB家族成员。ALKBH5是第二个被发现的mRNA m6A去甲基化酶,在睾丸和肺中高表达；ALKBH5可以调控mRNA代谢和运输,并且与精子的生成密切相关。但是目前对ALKBH5如何识别mRNA上的m6A修饰及催化m6A去甲基化的分子机制仍不清楚。本文表达并纯化了ALKBH5不同片段,通过悬滴法筛选得到了可以进行衍射分析的ALKBH5晶体,在上海同步辐射光源收集到分辨率2.4A的衍射数据。数据分析显示ALKBH5晶体属于P212121空间群,一个不对称单位含一个蛋白分子。由于利用分子置换法无法解析ALKBH5的晶体结构,正在尝试利用Se-MAD法解析ALKBH5的晶体结构。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-8
缩略表  8-9
第一章文献综述  9-28
  1.1 RNA修饰碱基m6A的研究进展  9-16
    1.1.1 RNA修饰碱基概况  9
    1.1.2 m6A在mRNA中的分布  9-10
    1.1.3 m6A甲基转移酶  10-11
    1.1.4 m6A结合蛋白  11-12
    1.1.5 m6A去甲基化酶：FTO和ALKBH5  12-14
    1.1.6 m6A修饰和先天免疫  14-15
    1.1.7 m6A修饰的生物学意义  15-16
  1.2 肥胖相关基因FTO的研究  16-21
    1.2.1 FTO基因  16
    1.2.2 FTO基因与肥胖相关  16-17
    1.2.3 FTO基因对脂肪组织的中枢效应与直接影响  17-18
    1.2.4 FTO基因内含子区单核苷酸多态性与功能相关性  18-21
  1.3 FTO和ALKBH5是2OG加氧酶  21-23
    1.3.1 FTO和ALKBH5属于AlkB家族  21-22
    1.3.2 FTO/3-meT复合物晶体结构  22-23
  1.4 2OG加氧酶抑制剂的研究  23-27
    1.4.1 2OG加氧酶家族通用抑制剂模板  24-26
    1.4.2 2OG加氧酶底物竞争性抑制剂  26-27
    1.4.3 FTO抑制剂研究现状  27
  1.5 研究的主要内容和意义  27-28
第二章材料与方法  28-43
  2.1 实验材料及仪器  28-30
    2.1.1 试剂及抗体  28-29
    2.1.2 常用缓冲液及培养基的配制  29-30
  2.2 实验方法  30-43
    2.2.1 ALKBH5的基因克隆与载体构建  30-32
    2.2.2 大肠杆菌表达系统表达ALKBH5蛋白  32-33
    2.2.3 ALKBH5蛋白纯化  33-35
    2.2.4 ALKBH5蛋白的结晶筛选  35-36
    2.2.5 ALKBH5蛋白晶体衍射数据的收集  36
    2.2.6 FTO抑制剂的计算机辅助药物设计  36
    2.2.7 FTOΔ31-His融合蛋白的表达和纯化  36-37
    2.2.8 FTO抑制剂活性检测  37-38
    2.2.9 FTO过表达细胞系的构建  38-40
    2.2.10 mRNA中m6A的含量的测定  40-43
第三章结果与讨论  43-63
  3.1 ALKBH5蛋白的表达与纯化  43-48
    3.1.1 ALKBH5基因克隆  43
    3.1.2 ALKBH5蛋白的表达  43
    3.1.3 ALKBH5蛋白的纯化  43-45
    3.1.4 ALKBH5表达片段的优化  45-48
  3.2 ALKHB5的晶体培养与衍射数据收集  48-51
    3.2.1 ALKHB5的晶体培养与优化  48-49
    3.2.2 ALKHB5硒代衍生物蛋白的表达与结晶  49-50
    3.2.3 ALKBH5晶体衍射数据的收集  50-51
  3.3 FTO抑制剂的筛选  51-60
    3.3.1 FTO蛋白的纯化  51-52
    3.3.2 FTO抑制剂的初步筛选  52-53
    3.3.3 5种化合物抑制FTO对ssDNA上的m6A去甲基化  53-56
    3.3.4 化合物抑制FTO对ssRNA上的m6A去甲基化  56
    3.3.5 化合物靶标酶选择性  56-58
    3.3.6 FTO过表达HEK293细胞系的建立  58
    3.3.7 化合物细胞活性测定  58-60
  3.4 讨论  60-63
    3.4.1 ALKBH5可能具有20G加氧酶家族类似的催化结构  60
    3.4.2 ALKBH5可能具有特有的底物识别机制  60-61
    3.4.3 FTO抑制剂的筛选方法  61
    3.4.4 FTO抑制剂具有一定广谱性  61-62
    3.4.5 FTO抑制剂和药物  62-63
第四章结论与展望  63-64
  4.1 获得ALKBH5的晶体衍射数据  63
  4.2 筛选出多种FTO抑制剂  63-64
参考文献  64-74
致谢  74-75
附录一化合物编号及其分子式  75-76
附录二 HPLC检测小分子化合物对FTO的抑制作用  76-89
个人简历  89

RNA去甲基化酶FTO抑制剂的筛选及ALKBH5的晶体结构研究

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