学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

双光子成像量化观测小鼠卵母细胞染色体三维构象

作　者: 田宁
导　师: 马万云
学　校: 清华大学
专　业: 物理学
关键词: 双光子荧光成像量化分析卵母细胞染色体衰老氨甲喋呤
分类号: R321.1
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
下　载: 5次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

卵母细胞成熟要经历两次减数分裂过程，染色质逐渐卷曲凝聚成染色体。此过程中染色体构象(指染色体空间位置、形态、分布等)经历了许多复杂变化。如何可视化并原位定量分析染色体构象的“时-空”四维发育特点，对认识复杂的遗传与变异过程，及探讨重大疾病的机理有重要作用。由于卵母细胞体积大、光散射强、对发育环境敏感，因此要在微干扰条件下，原位观测并量化分析卵母细胞染色体三维构象随发育的变化特点，存在较大困难，目前此类研究较少。本文利用穿透能力强、光损伤性小、三维分辨率高的双光子荧光成像系统和图像重构技术，提出量化分析卵母细胞染色体构象的方法，尝试通过染色体体积、表面积、类球因子（RF）、平均距离、粘连程度、包裹染色体圆柱的高宽比（H/D）等指标定量描述染色体的形态、形貌、空间分布等构象特点。并将该方法应用于诱发有机体生理环境改变的内因“衰老”和外因“氨甲喋呤（MTX）”对小鼠卵母细胞染色体构象影响的研究中。我们的研究结果表明：衰老导致卵母细胞质量下降。在第一次减数分裂前中期和中期，衰老干扰染色体的正常凝聚，引起染色体平均体积和表面积增大，平均距离缩短，粘连加重，形成团状体。在第二次减数分裂中期，衰老增加了小鼠体内成熟卵母细胞染色体错误排列的几率，并造成染色体的总体积、总表面积、H/D值增大。衰老还影响了卵胞质内DNA甲基转移酶蛋白的空间定位及表达水平。MTX是常用的抗肿瘤药物，但其具有干扰叶酸代谢功能，可能引起生殖异常。实验结果表明，腹腔注射MTX可造成小鼠体内成熟卵母细胞染色体异常空间排布比率升高、纺锤体形态改变。亚叶酸钙和自身代谢两种回救方式都可缓解MTX对体内成熟卵母细胞的毒副影响，恢复染色体空间排布及纺锤体形态至正常状态。本文还提出一种实时观测减数分裂纺锤体四维运动的便捷方法，并通过空间位置、速度、加速度等指标量化分析其运动特点。该方法基于我们观察到的一种重要实验现象：无损染料Fura-2标记小鼠活卵母细胞内钙离子，由于Fura-2与钙离子结合后双光子激发截面减小，钙离子的聚集使第一次减数分裂中期染色体赤道板两侧的纺锤体区域，形成两个对称荧光弱区。此现象即荧光弱区与纺锤体共定位，通过实时追踪活卵母细胞内荧光弱区的运动，可获知纺锤体的动态行为。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-9
主要符号对照表  9-11
第1章引言  11-14
  1.1 选题背景及意义  11-12
  1.2 论文目标与任务  12-14
第2章荧光显微成像技术基础及研究进展  14-39
  2.1 荧光产生的基本原理  14-19
    2.1.1 分子荧光的产生  14-16
    2.1.2 荧光产生的其他相关概念  16-18
    2.1.3 荧光性质总结  18-19
  2.2 荧光显微镜  19-37
    2.2.1 共聚焦激光扫描荧光显微镜  19-21
    2.2.2 双光子荧光显微镜  21-32
    2.2.3 超高分辨率荧光显微镜  32-37
  2.3 本章小结  37-39
第3章实验方法  39-57
  3.1 生物样品制备  39-47
    3.1.1 小鼠卵母细胞发育简介  39-40
    3.1.2 减数分裂过程简介  40-42
    3.1.3 卵母细胞体外成熟过程简介  42-43
    3.1.4 小鼠 GV 期卵母细胞获取及体外培养  43-44
    3.1.5 小鼠体内成熟卵母细胞采集  44-45
    3.1.6 荧光标记  45-47
  3.2 荧光成像方法  47-50
    3.2.1 荧光染料的双光子激发  48
    3.2.2 TPLSM 系统实验装置及成像条件设置  48-50
  3.3 图像处理方法  50-53
  3.4 卵母细胞内染色体空间构象的量化分析参数  53-55
    3.4.1 第一次减数分裂期染色体空间构象的量化分析参数  53-55
    3.4.2 第二次减数分裂中期染色体空间构象的量化分析参数  55
  3.5 本章小结  55-57
第4章衰老对小鼠卵母细胞染色体空间构象的影响  57-74
  4.1 本章引论  57-58
  4.2 衰老对小鼠卵母细胞染色体空间构象影响的实验设计  58-59
  4.3 第一次减数分裂过程中衰老对小鼠卵母细胞染色体空间构象的影响  59-67
    4.3.1 生物样品及荧光成像  59-60
    4.3.2 第一次减数分裂期小鼠卵母细胞染色体空间构象的量化分析参数  60
    4.3.3 统计分析  60
    4.3.4 实验结果与讨论  60-67
  4.4 第二次减数分裂中期（MII）衰老对小鼠体内成熟卵母细胞染色体空间构象及 DNA 甲基转移酶蛋白表达的影响  67-73
    4.4.1 生物样品及荧光成像  67
    4.4.2 小鼠体内成熟卵母细胞染色体构象及 DNMT 蛋白的量化分析参数  67-68
    4.4.3 统计分析  68
    4.4.4 实验结果与讨论  68-73
  4.5 本章小结  73-74
第5章氨甲喋呤对小鼠体内成熟卵母细胞染色体空间构象的影响  74-103
  5.1 本章引论  74-77
  5.2 MTX 对小鼠体内成熟卵母细胞染色体构象影响的实验设计  77-81
    5.2.1 对照组小鼠的模型建立  77
    5.2.2 小鼠体内成熟卵母细胞受 MTX 影响的模型建立  77-79
    5.2.3 缓解体内成熟卵母细胞受 MTX 毒性影响的回救模型建立  79-81
  5.3 腹腔注射 MTX 对小鼠体内成熟卵母细胞染色体构象的影响  81-91
    5.3.1 生物样品及荧光成像  81
    5.3.2 量化分析参数及统计学检验  81
    5.3.3 实验结果与讨论  81-91
  5.4 亚叶酸钙（CF）缓解 MTX 对小鼠体内成熟卵母细胞毒副影响的研究  91-95
    5.4.1 生物样品及荧光成像  91-92
    5.4.2 统计分析  92
    5.4.3 实验结果与讨论  92-95
  5.5 自身代谢缓解 MTX 对小鼠体内成熟卵母细胞毒副作用的研究  95-97
    5.5.1 生物样品及荧光成像  95
    5.5.2 统计分析  95
    5.5.3 实验结果与讨论  95-97
  5.6 小鼠体内成熟卵母细胞中纺锤体形态确立  97-101
    5.6.1 生物样品及荧光成像  98
    5.6.2 统计分析  98
    5.6.3 实验结果与讨论  98-101
  5.7 本章小结  101-103
第6章实时观测小鼠活卵母细胞纺锤体四维运动的新方法  103-114
  6.1 本章引论  103-104
  6.2 实验材料与方法  104-105
    6.2.1 卵母细胞制备  104
    6.2.2 荧光染料介绍  104
    6.2.3 小鼠活卵母细胞内钙离子与染色体双色荧光标记  104-105
    6.2.4 小鼠卵母细胞内纺锤体免疫荧光标记  105
    6.2.5 TPLSM 系统及成像参数设置  105
  6.3 实验结果与讨论  105-112
    6.3.1 钙离子荧光弱区与纺锤体关系确立  105-107
    6.3.2 钙离子荧光弱区旋转运动分析  107-110
    6.3.3 纺锤体旋转运动的动力学关系探讨  110-112
  6.4 本章小结  112-114
第7章总结  114-118
  7.1 论文总结  114-116
  7.2 创新点  116
  7.3 展望  116-118
参考文献  118-130
致谢  130-132
附录 A 唐氏综合症患者外周血淋巴细胞内 21#染色体的空间构象  132-137
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果  137-138

双光子成像量化观测小鼠卵母细胞染色体三维构象

内容摘要

全文目录

相似论文