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利用基因芯片技术研究冬虫夏草对缺血性中风机制的探讨

作　者: 武丽斐
导　师: 刘振权
学　校: 北京中医药大学
专　业: 中西医结合基础
关键词: 冬虫夏草大脑中动脉阻塞基因芯片实时荧光定量PCR
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

脑血管疾病是中老年人的常见病之一,具有高发病率、高致残率、高复发率、高死亡率的特点,已经成为了目前疾病三大死亡原因之一,该病以中风为主,尤其以缺血性脑中风最为常见,而且近年来缺血性中风的发病率呈上升趋势,占中风的80%。虽然中西医学已对其进行了不少的研究,但至今其发病机制还不十分清楚,缺乏疗效肯定的治疗药物。冬虫夏草作为我国一种传统的名贵中药材,富含了大量的蛋白质及氨基酸多糖、有机酸、多种微量元素、甘露醇、核苷及麦角甾醇类等诸多化学成分,被广泛地用来防治急慢性肾功能衰竭、慢性肾炎、慢性支气管炎、肿瘤、高血脂和心律失常等多系统疾病。本课题组在前期实验中,已初步研究了冬虫夏草对局灶性脑缺血大鼠模型的神经保护作用以及炎症反应的作用机制,尽管肯定了其对缺血损伤的脑组织有一定的改善与保护作用,但对于冬虫夏草干预后大鼠脑组织基因表达谱的改变,到目前为止仍是一个未知课题,且尚无相关文献报道。为此,我们将利用基因芯片技术对脑缺血后基因表达谱的改变及冬虫夏草干预脑缺血后基因表达谱的改变进行研究,可能为治疗缺血性中风提供新的靶标。目的：应用基因芯片技术研究冬虫夏草对局灶性脑缺血大鼠模型脑组织基因表达谱的影响,进一步在分子水平上探讨,冬虫夏草防治缺血性脑损伤的作用机制。方法：1.利用线栓法制备大鼠大脑中动脉脑缺血模型,分别在缺血24h,48h,72h对其神经功能缺失症状进行评分,根据神经功能缺失评分的行为学方法观察冬虫夏草对局造性脑缺血大鼠的神经保护作用；2.在缺血72小时后从脑组织的缺血半暗带区提取总RNA,应用大鼠全基因表达谱芯片检测冬虫夏草干预局灶性脑缺血大鼠后基因表达谱的变化；3.在分析基因芯片结果的基础上,应用实时荧光PCR法观察冬虫夏草对大鼠局灶性脑缺血72h后缺血半暗带区中Hcn2、Pcsk2、Flrt3、Nr3c2、Hspa12a、 S1c6a1mRNA表达的影响。以GAPDH为管家基因,获得Hcn2、Pcsk2、Flrt3、Nr3c2、 Hspa12a、S1c6a1mRNA的相对含量并做组间比较。结果：1.与假手术组相比,缺血24h,48h,72h时,模型组大鼠的神经功能损伤症状严重,具有明显显著性差异(P<0.01或P<0.05)；与模型组相比,冬虫夏草组可以明显改善模型组大鼠神经功能缺失症状,48h,72h时改善最为显著(P<0.01)。2.基因芯片结果显示,与模型组比较,冬虫夏草干预后共有40个基因的表达水平发生了明显变化(其中35个差异基因上调,5个差异基因下调),但冬虫夏草可直接调控的靶标基因中有功能注释的只有21个(其中,6个基因与神经保护和神经再生相关,2个基因与抗氧化及相关蛋白质降解相关,剩余几个基因分别与氨基酸、葡萄糖代谢、信号转导、细胞凋亡诱导等相关)。3.实时荧光PCR结果显示,芯片与Real-time PCR结果表达基本一致,验证了芯片的可靠性。具体表现为：与假手术组相比,模型组中Hcn2、Pcsk2、Flrt3、 Nr3c2、Hspal2a、S1c6a1mRNA表达均显著下调(P<0.01或P<0.05)；与模型组相比,冬虫夏草组可以有效的逆转Hspal2amRNA表达下调,有显著性差异(P<0.05),同时,冬虫夏草组也可逆转Pcsk2、Flrt3、S1c6a1mRNA表达的下调,但无显著性差异。结论：1.通过神经功能缺失评分的行为学方法观察,冬虫夏草可以改善脑缺血大鼠的神经功能缺失症状,对局灶性脑缺血大鼠的神经元起到一定的保护作用；2.大鼠基因芯片分析的结果显示冬虫夏草调控的差异表达基因主要通过抗炎、抗凋亡、抗氧化等途径对缺血性神经元起到保护作用,还可以通过神经再生等作用对缺血部位的脑组织进行修复等等；3.基于芯片的结果,利用Real-time PCR技术证实Hcn2、Pcsk2、Flrt3、 Nr3c2、Hspal2a、Slc6a1因子在转录水平上的上调可能是冬虫夏草干预脑缺血损伤的发生发展过程中起关键作用的分子基础,对于其它基因的调控作用还有待进一步实验的研究。

全文目录

中文摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
中英文名词术语对照表  10-11
第一部分综述  11-28
  综述一中西医学对缺血性中风治疗的研究进展  11-21
    中医学对缺血性中风病因病机的认识  11-13
    中医对缺血性中风的治疗  13-14
    西医学对缺血性中风病理生理学机制的认识  14-16
    西医对缺血性中风的治疗  16-17
    小结  17
    参考文献  17-21
  综述二冬虫夏草有效成分及其药理作用的研究进展  21-28
    冬虫夏草的有效成分  21-23
    冬虫夏草的药理作用  23-24
    小结  24-25
    参考文献  25-28
第二部分实验研究  28-69
  前言  28-29
  实验一、冬虫夏草对局灶性脑缺血大鼠神经元的保护作用  29-36
    材料和方法  29-31
    结果  31-32
    讨论  32-34
    参考文献  34-36
  实验二、冬虫夏草对脑缺血大鼠基因表达谱的影响  36-59
    材料和方法  36-42
    结果  42-54
    讨论  54-56
    参考文献  56-59
  实验三、实时荧光定量PCR技术检测冬虫夏草对缺血靶标基因的转录水平的影响  59-68
    材料和方法  59-61
    结果  61-65
    讨论  65-66
    参考文献  66-68
  结论  68-69
致谢  69-70
个人简历  70

利用基因芯片技术研究冬虫夏草对缺血性中风机制的探讨

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