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道地产区丹参内生真菌组成及其功能的初步研究

作　者: 王萌
导　师: 严铸云
学　校: 成都中医药大学
专　业: 生药学
关键词: 丹参内生真菌道地药材 DGGE 丹参酮
分类号: R282
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

丹参(Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma)为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎。主要含丹参酮类和丹酚酸两类成分。河南、山东、四川是丹参的道地产区。道地药材质量除受遗传因素的主导外,适宜的生长环境也是形成其优良品质的必要条件。内生菌作为构成植物内环境的重要组成部分,与宿主植物长期协同进化,形成了互利共生的关系,与优质药材的形成有关。本研究采用纯培和非纯培结合法对道地产区丹参内生真菌的群落结构进行了研究,并通过内生真菌与丹参悬浮细胞共培养的方法,初步验证了内生真菌对丹参酮类代谢产物合成的影响。首先,纯培法从河南方城、山东临沂、四川中江3个产地15株丹参的根中分离得到48株内生真菌。经ITS区rDNA序列分析,鉴定为4纲7目8科8属9种,分属于子囊菌亚门和半知菌亚门,其中以其中Alternaria alternata (互隔交链孢霉)为优势菌种,占总菌株数的27.08%。其次,采用DGGE结合测序的方法对3个道地产区丹参内生真菌的群落结构进行了研究。基于真菌ITS区rDNA,采用nested-PCR方法,对3个道地产区丹参内生真菌群落结构进行了DGGE分析,并将DGGE图谱中可见条带切胶回收后克隆测序。所得序列进行BLAST比对后,获得18种菌,其中,纯培法中未得到的有12种内生真菌在DGGE中可见,4纲7目7科7属8种(其中有4种无法确定其种类),以Alternaria alternata (互隔交链孢霉)为优势种。遗传多样性分析表明,丹参内生真菌的多样性与其所处的环境关系密切,环境条件相似的产区内生真菌遗传多样性越相近。纯培法与非纯培法结合共获得内生真菌21种。最后,通过内生真菌与丹参悬浮细胞共培养结合HPLC法测定培养物种丹参酮类化合物的含量,结果表明内生真菌对丹参酮类化合物的积累与合成产生影响。不同的内生真菌对丹参酮类化合物的影响不同,同一种内生真菌对丹参酮类化合物也可产生不同的影响。筛选出了促进丹参酮类化合物的合成的菌株,为进行内生真菌影响丹参品质的深入研究奠定了基础。综上所述,内生真菌的研究中,纯培法与非纯培法具有互补性。道地产区丹参内生真群落结构具有相似性又具有各自的特异性,丹参内生真菌群落多样性随着环境的改变而改变。丹参内生真菌对其有效成分的积累产生影响,说明内生真菌的影响也是丹参药材道地性形成原因之一。本研究从微生态角度探讨了丹参道地性的形成机制,为中药道地性的研究提供了新的思路。

全文目录

中文摘要  7-9
Abstract  9-11
1 引言  11-16
  1.1 研究背景  11-13
  1.2 研究目的和意义  13-14
  1.3 研究目标  14
  1.4 主要研究内容  14-15
  1.5 技术路线图  15-16
2. 丹参内生真菌纯培养分析  16-30
  2.1 试验材料  16
  2.2 仪器和试剂  16-17
    2.2.1 主要仪器  16
    2.2.2 主要试剂  16-17
  2.3 试验方法  17-23
    2.3.1 内生真菌的分离、纯化和保存  17
    2.3.2 内生真菌的PCR-DGGE分析  17-22
    2.3.3 测序及序列比对分析  22-23
  2.4 试验结果  23-30
    2.4.1 内生真菌DNA电泳检测结果  24
    2.4.2 内生真菌ITS区特异性扩增结果  24-25
    2.4.3 DGGE分析结果  25-30
  2.5 小结与讨论  30
3. 丹参内生真菌的非纯培养分析  30-50
  3.1 试验材料  30-31
  3.2 仪器和试剂  31-32
    3.2.1 试验仪器  31
    3.2.2 主要试剂  31-32
  3.3 试验方法  32-37
    3.3.1 基因组DNA的提取  32-34
    3.3.2 真菌ITS区特异性扩增  34
    3.3.3 DGGE分析  34-37
  3.4 试验结果  37-49
    3.4.1 DNA提取结果  37-38
    3.4.2 PCR结果  38
    3.4.3 内生真菌DGGE分析  38-41
    3.4.4 内生真菌多样性分析  41-43
    3.4.5 克隆及测序结果  43-47
    3.4.6 纯培法与非纯培法的比较  47-49
  3.5 小结与讨论  49-50
4. 内生真菌对丹参酮类成分积累的影响  50-60
  4.1 试验材料  50
  4.2 仪器与试剂  50-51
    4.2.1 试验仪器  50-51
    4.2.2 主要试剂  51
  4.3 试验方法  51-58
    4.3.1 丹参愈伤组织悬浮培养体系的建立  51-52
    4.3.2 丹参悬浮培养物与内生真菌共培养  52
    4.3.3 丹参酮类成分的含量测定  52-58
  4.4 试验结果  58-59
    4.4.1 样品测定结果  58-59
  4.5 小结与讨论  59-60
5. 结论与讨论  60-62
  5.1 结论  60-61
  5.2 创新点  61-62
  5.3 讨论  62
参考文献  62-64
文献综述  64-76
  参考文献  72-76
附图  76-79
致谢  79-80
在读期间公开发表的学术论文  80-81

道地产区丹参内生真菌组成及其功能的初步研究

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