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戊唑醇对映异构体对大型溞的毒性差异及双酰胺类杀虫剂结合位点的选择性研究
作 者: 齐素贞
导 师: 王成菊
学 校: 中国农业大学
专 业: 农药学
关键词: 戊唑醇 大型溞 双酰胺类杀虫剂 鱼尼丁受体 选择性
分类号: S948
类 型: 博士论文
年 份: 2014年
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内容摘要
农药是农业中重要的生产物资,是保证作物产量和质量的重要手段,明确不同结构和类型农药的作用机理和作用特性,可以为开发新型高效安全农药提供支持和引导。结合当前农药领域的研究热点,本论文分别研究了手性三唑类杀菌剂戊唑醇(rac-teb)对大型溞的毒性作用差异和两种双酰胺类杀虫剂在鱼尼丁受体(RyR)上结合位点的选择特性,具体研究成果如下:1.三唑类杀菌剂戊唑醇及其对映异构体对大型溞的毒性差异研究以纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)(CDMPC)为固定相手性拆分制得R-和S-teb,并分别测定了其对大型溞的48h急性运动抑制毒性、21d繁殖毒性和子代(F1代)14d恢复毒性差异。Rac-,R-和S-teb对大型溞的48h ECso(95%置信限)分别为3.5(3.3~3.8) mg/L,3.3(3.0~3.8)mg/L和2.7(2.3~3.1)mg/L,三者对大型溞的急性运动抑制毒性为中等且彼此之间毒性作用差异不显著。21d大型溞繁殖毒性试验中,以48h ECso值的1/10为上限,rac-, R-和5-teb的处理浓度均设定为0.01,0.05,0.10,0.20,0.30和0.40mg/Lo结果发现rac-, R-和S-teb均可显著地减少每只大型溞的总产溞数量[最低可观测效应浓度(LOEC, mg/L)分别为0.05,0.05,0.10),总繁殖胎数(LOEC分别为0.30,0.05,0.10),第一胎和第三胎的产幼溞数(LOEC分别为0.05,0.20,0.20;0.05,0.20,0.10),显著性地减少每只大型溞的蜕皮次数(LOEC分别为0.20,0.30,0.10),延长大型溞的性成熟(LOEC分别为>0.40,0.20,>0.40)和第一、第三胎产溞所需时间(LOEC分别为0.20,0.20,>0.40;0.10,0.10,0.10),使得大型溞的生长受到抑制,体长显著减少(LOEC分别为0.05,0.05,>0.40)。相同浓度处理下,rac-, R-和S-teb之间的毒性作用差异显著,强弱顺序为S->rac-≥R-teb,表明rac-, R-和5-teb之间存在显著的对映体选择毒性。14d F1代大型溞毒性恢复研究发现,当rac-teb处理F0代母溞的浓度不超过0.20mg/L时,F1代子溞的繁殖和生长发育基本可恢复,与对照组中大型溞的各项指标值差异不显著;当浓度高于0.20mg/L时,子溞的繁殖和生长会受到显著影响且不能恢复。S-teb暴露处理F0代母溞后对F1代子溞产生的影响>rac->R-teb,最小LOEC值仅为O.Olmg/L且在0.30或0.40mg/L下完全没有F2代子溞的产生。目前我国还没有水中戊唑醇残留量限值的规定,已报道的rac-teb在巴西地表水中的浓度为0.2-4.16μg/L,美国EPA报告地表水中戊唑醇最大浓度一般不超过13μg/L。本研究中最低处理浓度为O.Olmg/L时,rac-,R-和S-teb对F,代大型溞便可产生显著的不可恢复的影响,据此推测在长期暴露情况下,即使浓度低于0.01mg/L,环境中累积的rac-, R-和S-teb依然很有可能会对大型溞的繁殖和生长产生不可逆的影响,进而破坏水生生物种群稳态。根据本论文的研究发现,建议戊唑醇常规使用以外消旋体为佳,但应加强对其对映异构体在环境中的含量监测,以期建立可靠的戊唑醇及其对映异构体的环境控制标准,降低对非靶标水生生物产生的不良影响。2.双酰胺类杀虫剂结合位点的选择性研究本部分研究与加州大学-伯克利分校环境化学与毒理学实验室合作完成。自主合成新型放射性配基[3H]Chlo(氯虫苯甲酰胺),通过直接比较[3H]Ry(鱼尼丁),[3H]Chlo (氯虫苯甲酰胺)和[3H]Flu (氟虫双酰胺)与不同生物品系肌肉鱼尼丁受体(RyR)蛋白的特异性结合,推测两种双酰胺类杀虫剂在RyR上是否具体相同的作用位点,进而解释两种双酰胺类杀虫剂的物种选择特性。本论文选择龙虾(Lobster),兔子(Rabbit),四种昆虫品系包括家蝇(Musca domestica).蜜蜂(Apis mellifera),鳞翅目昆虫烟芽夜蛾(Heliothis virescens)和小地老虎(Agrotis ipsilon)制备RyR蛋白,测定ATP, Ca2+,非标记的Chlo, Cyan(氰虫苯甲酰胺),Flu, Ry对六种RyR蛋白与[3H]Ry,[3H]Chlo和[3H]Flu特异性结合的影响,结果发现[3H]Ry在六种生物品系RyR蛋白上都有结合位点,[3H]Chlo只与四种昆虫RyR有结合而[3H]Flu只与烟蚜夜蛾和小地老虎的RyR蛋白有结合。[3H]Ry与四种昆虫RyR蛋白的结合可以被Chlo, Cyan和Flu(家蝇除外)显著促进,二者龙虾与兔子体系中三者则作用不显著。在家蝇与蜜蜂体系内,Ry和Flu可促进[3H]Chlo的结合,在鳞翅目昆虫体系内,Chlo, Cyan和Flu则抑制[3H]Chlo的结合。[3H]Flu与烟蚜夜蛾和小地老虎RyR的结合可显著被Ry, Chlo, Cyan和Flu抑制。[3H]Chlo与[3H]Flu的结合对单一ATP或Ca2+的依赖度较弱,而ATP和Ca2+共同存在则可显著促进[3H]Chlo的结合反应。这说明ATP和Ca2+调控机制可能与Flu结合位点关系较弱,而与Ry和Chlo结合位点关系较强。通过烟芽夜蛾成虫RyR蛋白与[3H]Chlo和[3H]Flu的特异性结合反应判断两种双酰胺杀虫剂的结构-活性关系。结果发现在烟蚜夜蛾体系内,邻甲酰胺基苯甲酰胺类似物和邻苯二甲酰胺类似物均促进[3H]Ry的结合而抑制[3H]Chlo与[3H]Flu的结合,且两作用效果间相关性良好。在家蝇体系内,两种双酰胺类似物的作用效果不完全相同,邻甲酰胺基苯甲酰胺类似物可以促进[3H]Ry的结合而抑制[3H]Chlo的结合;邻苯二甲酰胺类似物可促进[3H]Chlo的结合而对[3H]Ry的结合影响不显著。这些发现说明两种双酰胺类杀虫剂具有明确的物种选择特性和结合位点差异性,Chlo和Flu在家蝇和蜜蜂RyR蛋白上具有相互偶联的两种不同结合位点,而在鳞翅目害虫RyR蛋白上具有相同的结合位点。本研究直接有力地证明双酰胺类杀虫剂的结合位点具有物种差异性,这对未来双酰胺类杀虫剂的结构优化和抗性机制评估具有重要的意义。
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全文目录
摘要 5-7 Abstract 7-9 缩略语 9-14 第一章 引言 14-28 1.1 三唑类杀菌剂研究进展 14-17 1.1.1 三唑类杀菌剂的发展历史 14-15 1.1.2 三唑类杀菌剂的作用机理 15-17 1.2 手性三唑类杀菌剂的研究现状 17-18 1.2.1 三唑类杀菌剂的手性拆分 17 1.2.2 三唑类杀菌剂的对映体选择特性研究现状 17-18 1.3 戊唑醇及其对映异构体研究现状 18-20 1.3.1 戊唑醇的理化性质和使用状况 18-19 1.3.2 戊唑醇对映异构体选择特性研究现状 19 1.3.3 戊唑醇对水生生物的毒性作用 19-20 1.4 鱼尼丁受体概述 20-21 1.5 鱼尼丁受体抑制剂的研发现状 21-23 1.5.1 邻苯二甲酰胺类鱼尼丁抑制剂的发展 21-22 1.5.2 邻甲酰胺基苯甲酰胺类鱼尼丁抑制剂的发展 22 1.5.3 双酰胺类杀虫剂作用机理 22-23 1.6 本研究的意义、主要内容和技术路线 23-28 1.6.1 研究意义 23-24 1.6.2 研究内容 24-25 1.6.3 技术路线 25-28 第二章 戊唑醇对映异构体的拆分及其在水体中浓度的测定 28-36 2.1 材料与方法 28-30 2.1.1 试验药品 28 2.1.2 试验仪器 28-29 2.1.3 戊唑醇对映异构体的拆分 29 2.1.4 戊唑醇及其对映异构体在水中的含量测定 29-30 2.1.5 数据处理与分析 30 2.2 结果分析与讨论 30-34 2.2.1 戊唑醇对映异构体的制备 30-31 2.2.2 rac-teb标准曲线的绘制 31-32 2.2.3 水体中rac-,R-及S-teb分析方法的验证 32 2.2.4 48h内水体中rac-,R-及S-teb浓度测定 32-34 2.3 本章小结 34-36 第三章 戊唑醇及其对映异构体对大型溞的毒性研究 36-58 3.1 材料与方法 36-39 3.1.1 试验药品 36 3.1.2 试验用水 36 3.1.3 试验生物 36-37 3.1.4 仪器设备 37 3.1.5 48h急性运动抑制毒性试验方法 37-38 3.1.6 21d慢性毒性试验方法 38 3.1.7 子代大型溞14d恢复毒性试验方法 38 3.1.8 数据处理与分析 38-39 3.2 结果分析与讨论 39-57 3.2.1 大型溞敏感性测试结果 39 3.2.2 rac-,R和S-teb对大型溞的48h急性毒性 39 3.2.3 rac-,R和S-teb对亲代(FO代)大型溞的21d慢性毒性 39-46 3.2.4 rac-,R和S-teb对F1代第一胎大型溞繁殖和生长发育的影响 46-51 3.2.5 rac-,R和S-teb对F1代第三胎大型溞的繁殖和生长发育的影响 51-56 3.2.6 讨论 56-57 3.3 本章小结 57-58 第四章 放射性配基[~3H]Chlo的合成及其与家蝇RyR蛋白的结合 58-72 4.1 材料与方法 58-64 4.1.1 试验仪器 58 4.1.2 试验药品及试剂 58-59 4.1.3 缓冲液的配制 59-60 4.1.4 [~3H]Chlo及其中间体的合成与表征 60-62 4.1.5 家蝇肌肉样品的收集 62 4.1.6 家蝇RyR蛋白的制备 62-63 4.1.7 [~3H]Chlo,[~3H]Ry与家蝇RyR蛋白的结合 63-64 4.1.8 Chlo,Cyan,Flu和Ry对[~3H]Chlo,[~3H]Ry与家蝇RyR蛋白结合反应的影响 64 4.1.9 数据处理 64 4.2 结果分析与讨论 64-70 4.2.1 [~3H]Chlo与[~3H]Ry与家蝇RyR的结合特征 65 4.2.2 Chlo,Cyan,Flu,Ry对[~3H]Chlo与家蝇RyR的结合影响 65-68 4.2.3 Ry,Chlo,Cyan和Flu对[~3H]Ry与家蝇RyR蛋白结合的影响 68-69 4.2.4 讨论 69-70 4.3 本章小结 70-72 第五章 [~3H]Ry,[~3H]Chlo及[~3H]Flu与不同生物RyR蛋白的结合 72-98 5.1 材料与方法 72-75 5.1.1 试验仪器 72 5.1.2 试验药品及试剂 72-73 5.1.3 缓冲液的配制 73 5.1.4 试验生物 73 5.1.5 不同生物RyR蛋白的制备 73 5.1.6 家蝇RyR蛋白的溶解 73 5.1.7 [~3H]Ry,[~3H]Chlo与[~3H]Flu与不同生物RyR蛋白的结合 73-74 5.1.8 ATP和Ca2+对[~3H]Ry,[~3H]Chlo及[~3H]Flu与不同生物RyR蛋白结合的影响 74 5.1.9 Chlo、Cyan、Flu和Ry对[~3H]Ry,[~3H]Chlo及[~3H]Flu与不同生物RyR蛋白结合的影响 74 5.1.10 数据处理 74-75 5.2 结果分析与讨论 75-96 5.2.1 [~3H]Ry与不同生物RyR蛋白的结合 75-81 5.2.2 [~3H]Chlo与不同生物RyR蛋白的结合 81-86 5.2.3 [~3H]Flu与不同生物RyR蛋白的结合 86-91 5.2.4 [~3H]Ry和[~3H]Chlo与家蝇溶解RyR蛋白的结合 91-93 5.2.5 讨论 93-96 5.3 本章小结 96-98 第六章 双酰胺类似物对[~3H]Ry,[~3H]Chlo和[~3H]Flu与烟芽夜蛾和家蝇RyR蛋白结合的影响 98-122 6.1 材料与方法 98-101 6.1.1 实验仪器 98 6.1.2 实验药品与试剂 98-99 6.1.3 缓冲液的配制 99 6.1.4 实验生物 99 6.1.5 不同生物RyR蛋白的制备 99 6.1.6 [~3H]Ry,[~3H]Chlo和[~3H]Flu与离体RyR蛋白的结合 99-100 6.1.7 双酰胺类似物对烟芽夜蛾及草地烟夜蛾的毒性测定 100 6.1.8 双酰胺类似物对家蝇的毒性测定 100 6.1.9 双酰胺类似物对[~3H]Ry和[~3H]Chlo与活体家蝇RyR蛋白结合的影响 100 6.1.10 数据处理 100-101 6.2 结果分析与讨论 101-120 6.2.1 [~3H]Chlo,[~3H]Flu和[~3H]Ry与烟芽夜蛾RyR蛋白的结合 101-109 6.2.2 放射性配基[~3H]Chlo和[~3H]Ry与家蝇RyR蛋白的结合 109-117 6.2.3 双酰胺类似物对配基与烟芽夜蛾及离体家蝇RyR蛋白作用效果对比 117-119 6.2.4 讨论 119-120 6.3 本章小结 120-122 第七章 结论与展望 122-126 7.1 结论 122-123 7.1.1 rac-,R-和S-teb对大型溞的毒性差异 122 7.1.2 双酰胺类杀虫剂结合位点的选择性差异 122-123 7.2 本研究的创新点 123 7.3 未来工作展望 123-126 参考文献 126-134 致谢 134-136 附录 136-140 作者简介 140 教育背景 140 攻读博士学位期间已发表论文情况 140-141
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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 水产药物学、药理学
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