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大肠杆菌噬菌体的分离纯化及其在海水养殖中的应用

作　者: 陈海阳
导　师: 林琼武
学　校: 厦门大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 大肠杆菌噬菌体水产养殖应用
分类号: S917.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

噬菌体是一类感染原核生物的病毒,在自然界中广泛分布,种类繁多。近年来,由于养殖业多采用高密度培养以及抗生素的滥用,导致大量耐药菌株出现,噬菌体作为一种更有效的治疗手段,正越来越受到关注。本文运用直接法在厦门港、演武大桥桥头排污口、厦门大学南大沟、芙蓉湖、珍珠湾等处进行采样,经菌悬液富集后,以双层琼脂平板法和液体纯化法分离纯化出2株大肠杆菌裂解性噬菌体EX01、EX02,进行宿主感染试验,测定了EX01低温保存的效价和一步繁殖曲线,并使用EX01分别处理生活污水,预处理养殖用水,处理养殖中期用水和青蟹暂养海水。其结果将为海水养殖病害防治提供资料,具有重要理论意义和应用价值。主要结果如下：1、以大肠杆菌为宿主,从自然水体中分离得到2株大肠杆菌裂解性噬菌体EX01和EX02。经电镜观测,EX01为蝌蚪状具可收缩尾的噬菌体,其头部为三十面体,约70×110nm,尾部长约100～130nm,尾宽约18～22nm,有尾鞘、基板、尾丁、尾丝等结构,隶属肌尾病毒科(Myoviridae). EX02为短尾噬菌体,其头部为二十面体,大小为20nm,尾部长约2-3nm,隶属短尾病毒科(Podoviridae)。2、使用噬菌体EX01和EX02对5株不同细菌进行宿主感染试验,结果显示EX01能感染工程菌E. coli DH5a和另外2株分离自生活污水的大肠杆菌(E.coli S1和E. coli S2),是一株广谱噬菌体；EX02仅能感染E. coli S20EX01和EX02均无法感染弧菌W(Vibrio sp.)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas puticd)。3、针对噬菌体EX01进行低温保存的效价试验,噬菌体以悬液形式分装-18℃保存,每7d测定一次,直至检测不到噬菌体。结果显示悬液低温保存法能保存噬菌体30d以上,保存的56d内EX01仍然具有感染性。4、测定噬菌体EX01感染大肠杆菌E.coli S1的一步繁殖曲线,结果表明,EX01的潜伏期在25min左右,裂解期为25～35min。在15min内吸附率为85.6%,裂解完成后平均裂解量为135.05。5、利用效价为1.81X108pfu·mL-1的噬菌体EX01处理生活污水1h,结果显示总菌数减少34.6%,大肠杆菌数减少89.0%。6、利用噬菌体EX01预处理新鲜未使用的养殖海水,处理前后均未检出细菌,表明该海水经过过滤预处理,含菌量极低,适合进行养殖活动。7、利用效价为1.47X108pfu·mL-1的噬菌体EX01处理采自牡蛎育苗缸的养殖中期用水1h,结果显示总菌数减少了13.3%,大肠杆菌数减少82.4%。8、利用效价为1.04×108pfu·mL-1的噬菌体EX01处理青蟹暂养海水1h,结果显示总菌数增加7.7%左右,大肠杆菌数减少98.3%。9、将噬菌体EX01的效价设置为7.02x102pfu·mL-1,7.02x103pfu·mL-1,…,7.02x106pfu·mL-1.分别处理青蟹暂养海水,取样时间为1h、2h、3h。结果显示在同一效价条件下,总菌数随着处理时长的增加而增加,大肠杆菌数随着处理时长增加呈下降趋势,且在降低98～99%后维持稳定。在同一时长条件下,总菌数随着噬菌体效价增加先减小后增加,最小值对应的效价为7.02x103pfu·mL-1,大肠杆菌数随着噬菌体效价增加呈下降趋势,且在降低98～99%后维持稳定。以上结果表明,EX01能有效降低水环境中大肠杆菌浓度,具有应用于水产养殖的潜力。

全文目录

摘要  10-12
ABSTRACT  12-15
第一章绪论  15-29
  1.1 噬菌体的生物学特性简介  15-18
    1.1.1 噬菌体的发现及其名称的由来  15
    1.1.2 噬菌体的分类与作用机制  15-18
  1.2 国内外相关研究动态  18-25
    1.2.1 噬菌体的分离纯化方法  18-20
    1.2.2 噬菌体在生物防治方面的应用  20-24
    1.2.3 噬菌体用于水产养殖面临的问题  24
    1.2.4 噬菌体应用的发展趋势  24-25
  1.3 本研究的主要内容和基本思路  25-28
    1.3.1 科学问题的提出  25
    1.3.2 本研究的主要内容  25-26
    1.3.3 本研究的基本思路  26-28
  1.4 本研究的目的和意义  28-29
    1.4.1 目的  28
    1.4.2 意义  28-29
第二章材料与方法  29-37
  2.1 材料  29-30
    2.1.1 宿主菌的来源  29
    2.1.2 水样的来源  29
    2.1.3 培养基  29-30
  2.2 器材  30
  2.3 实验方法  30-37
    2.3.1 宿主菌的分离纯化  30
    2.3.2 菌悬液的制备  30-31
    2.3.3 噬菌体的分离纯化  31
    2.3.4 噬菌体的形态观察  31-32
    2.3.5 高效价噬菌体的制备  32
    2.3.6 噬菌体的宿主感染  32
    2.3.7 噬菌体低温保存的效价测定  32-33
    2.3.8 噬菌体一步繁殖曲线的测定  33-34
    2.3.9 噬菌体处理生活污水  34-35
    2.3.10 噬菌体预处理养殖用水  35
    2.3.11 噬菌体处理养殖中期用水  35
    2.3.12 噬菌体处理青蟹暂养海水  35-36
    2.3.13 不同时长不同效价噬菌体处理青蟹暂养海水  36-37
第三章结果与分析  37-51
  3.1 宿主菌的分离纯化与形态观察  37-38
  3.2 噬菌体的分离纯化与形态观察  38-40
    3.2.1 噬菌体的分离纯化  38-39
    3.2.2 噬菌体的形态观察  39-40
  3.3 噬菌体的宿主感染  40-42
  3.4 噬菌体低温保存的效价测定  42
  3.5 噬菌体的一步繁殖曲线  42-44
  3.6 噬菌体处理生活污水结果  44-45
  3.7 噬菌体预处理养殖用水结果  45-46
  3.8 噬菌体处理养殖中期用水结果  46-47
  3.9 噬菌体处理青蟹暂养海水结果  47-48
  3.10 不同时长不同效价噬菌体处理青蟹暂养海水结果  48-51
第四章讨论  51-59
  4.1 分离噬菌体的方法探讨  51
  4.2 噬菌体保存效果的探讨  51-53
  4.3 噬菌体的宿主谱与治疗效能的关系  53
  4.4 噬菌体用于处理生活污水的探讨  53
  4.5 噬菌体用于处理养殖用水的探讨  53-54
  4.6 环境中噬菌体与宿主菌的消长关系  54
  4.7 噬菌体对人体的安全性探讨  54-55
  4.8 水产养殖病害的综合防治  55-59
    4.8.1 多品种混养  55-56
    4.8.2 浮游微藻调控  56
    4.8.3 拮抗菌  56-57
    4.8.4 免疫药物  57-59
第五章结语  59-61
  5.1 主要研究成果  59-60
  5.2 创新和特色  60
  5.3 不足之处  60
  5.4 展望  60-61
参考文献  61-67
在学期间参与的科研活动和发表的文章  67-68
致谢  68-69
附录一在学期间的主要科研成果  69

大肠杆菌噬菌体的分离纯化及其在海水养殖中的应用

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