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大鳞副泥鳅GPR30基因的克隆及EE2暴露对其表达的影响

作　者: 章霞
导　师: 王在照
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 渔业
关键词: 雌激素膜受体 GPR30 大鳞副泥鳅 EE2 实时定量PCR
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

环境内分泌干扰物(endocrine-disrupting chemicals, EDCs)存在的广泛性以及其对人类和其他动物潜在的巨大危害,已不容人类忽视。鱼类作为水环境中的高等生物,是水中各种EDCs富集的重要对象,利用鱼类来研究EDCs对生物生理生化功能的影响存在着重要的意义。现今关于多种鱼类雌激素受体和EDCs相关关系的研究结果都表明环境内分泌干扰物能有效结合雌激素受体并进而对生物的生长发育产生影响,这使得有关于对雌激素受体的研究课题炙手可热,而目前对雌激素受体研究的热点主要在于雌激素核受体(Estrogen Receptor, ER)、雌激素膜性受体(G protein-coupled receptor30, GPR30)的分子特性及其调控途径、功能功用以及相互之间的关系,目前通过现今对雌激素受体的研究中发现GPR30是一种区别于经典的雌激素核受体ERα、β,分布于细胞膜或者内质网新型的雌激素膜受体,许多研究在人类的恶性肿瘤组织,如乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌中发现有GPR30过表达,并且指出GPR30与生物发生发育也有着密不可分的联系,为此GPR30已成为国际关注的研究热点。近20年来,众多的学者致力于研究GPR30的功能特征,作用机制以及与经典雌激素核受体ERα、β之间的作用关系,并取得了一定的进展。大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)属鲤形目(Cyprinformes)鳅科(Cobitidae)是常见的鲤形目鳅科鱼类,分布于长江中下游及其附属水体中。大鳞副泥鳅不仅有很好的营养价值,被我国推荐养殖的经济鱼类,而且被开发作为一种新型实验模式生物。众多研究表明大鳞副泥鳅有着与其他生物模式鱼(稀有鮈鲫,青鳉,斑马鱼等)相似的实验特性,它具有多次产卵的特性和相对较长的性成熟时间,并且相对于其他野生鱼类,大鳞副泥鳅合适的个体大小适合在实验室养殖,以及病害和繁殖问题已经得到了一定程度的解决。为此,大鳞副泥鳅也正逐渐成为新型的生物学和遗传学研究的实验材料特有的一种小型的鲤科鱼类,被广泛用于水生毒理学的研究,是一种理想的研究EDCs的模式鱼类。为研究EDCs对大鳞副泥鳅GPR30基因mRNA的干扰作用,并探究EDCs在体内的作用机制,本实验通过同源克隆和RACE的方法获得了大鳞副泥鳅GPR30cDNA序列,该基因全长2152bp,阅读框全长1062bp,编码353个氨基酸。序列分析发现PdGPR30氨基酸序列含有其他物种GPR30序列的基本特征,具有经典的7次跨膜疏水区域和一个区别于多数GPCRs的保守序列,即位于第三跨膜区后第二胞质内袢上的Asp-Arg-Tyr三联体(DRY),同其他物种的GPR30一样,PdGPR30在细胞外域有3个潜在的氨基端糖基化位点,多重序列比对及系统发育树分析表明,该基因氨基酸序列与斑马鱼的GPR30氨基酸序列相似性最高,达92.9%。荧光定量PCR分析表明：GPR30在成鱼卵巢中表达最高,在雄鱼肠道里面表达最低,相差1404倍。用2个月龄的雌性大鳞副泥鳅幼EE2暴露试验,设三个暴露浓度：EE2(1ng/L,5ng/L,25ng/L)暴露21天后,实时定量PCR的方法检测GPR30、ERa基因mRNA的变化。同对照相比结果显示,低浓度EE2处理雌性幼鱼后,1ng/L EE2处理组的卵巢和5ng/L EE2处理组的肝脏中GPR30有略微的增长,ERα mRNA在肝脏中随着EE2浓度的增高,相对于对照组呈现显著性增长。结果表明GPR30氨基酸序列比对与其他脊椎动物相似性较高,结构域一致,且GPR30mRNA在雌雄大鳞副泥鳅的性腺中差异性表达,在卵巢中的表达量比精巢中高702倍,推测大鳞副泥鳅GPR30与哺乳动物GPR30不仅结构相似而且功能上也相似,大鳞副泥鳅GPR30与雌激素效应存在密切关系。在EE2暴露实验中,GPR30mRNA表达没有显著性差异,而ERa mRNA表达明显增高,目前的结果显示在基因转录水平上GPR30与ERa可能不存在直接的显著的相关关系,这将需要采取更全面更精确地实验计划和检测指标来明确各类雌激素受体之间的关系。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-13
第一章文献综述  13-17
  1.1 前言  13
  1.2 雌激素受体(ER)的研究进展  13-15
    1.2.1 雌激素膜受体(GPR30)的概述  13-14
    1.2.2 ERα的概述  14-15
    1.2.3 GPR30和ERα之间存在的联系  15
  1.3 雌激素受体与环境内分泌干扰物的关系  15-16
  1.4 试验材料的选择  16
  1.5 本文研究的目的和意义  16-17
第二章大鳞副泥鳅GPR30基因全长的克隆与表达  17-33
  2.1 前言  17
  2.2 材料试剂  17-18
    2.2.1 实验器材  17-18
    2.2.2 实验试剂  18
    2.2.3 实验溶液和配制方法  18
  2.3 实验方法  18-26
    2.3.1 总RNA的提取  18-19
    2.3.2 大鳞副泥鳅GPR30部分克隆  19-20
    2.3.3 GPR30基因3’,5’末端序列的快速扩增  20-23
    2.3.4 纯化回收  23
    2.3.5 连接实验  23-24
    2.3.6 转化过程  24
    2.3.7 阳性克隆的选择  24-25
    2.3.8 测序及生物信息学分析  25
    2.3.9 实时定量PCR检测GPR30基因的组织表达  25-26
  2.4 结果与分析  26-31
    2.4.1 总RNA的检测  26-27
    2.4.2 大鳞副泥鳅GPR30基因的克隆  27
    2.4.3 大鳞副泥鳅GPR30基因全长cDNA的序列分析  27-30
    2.4.4 大鳞副泥鳅GPR30系统发育分析  30
    2.4.5 大鳞副泥鳅GPR30基因的组织表达结果及分析  30-31
  2.5 讨论  31-32
    2.5.1 GPR30基因结构与功能之间的关系  31-32
    2.5.2 GPR30基因组织分布与功能之间的关系  32
  2.6 小结  32-33
第三章 EE2对大鳞副泥鳅幼鱼暴露后GPR30基因表达的影响  33-37
  3.1 前言  33
  3.2 材料与试剂  33
    3.2.1 主要仪器  33
    3.2.2 主要试剂  33
    3.2.3 实验用鱼  33
    3.2.4 EDCs暴露实验  33
  3.3 实验技术  33-34
    3.3.1 大鳞副泥鳅总RNA的提取及其反转录  33-34
    3.3.2 实时定量PCR  34
    3.3.3 数据分析  34
  3.4 结果与分析  34-35
  3.5 讨论  35-36
  3.6 小结  36-37
结论  37-38
参考文献  38-41
附录  41-44
缩略词  44-45
致谢  45-46
作者简介  46

大鳞副泥鳅GPR30基因的克隆及EE2暴露对其表达的影响

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