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线粒体mtDNA⁴⁹⁷⁷缺失突变质粒标准品的构建

作　者: 何婷
导　师: 孔维佳；师洪
学　校: 华中科技大学
专　业: 耳鼻咽喉科学
关键词: 实时定量PCR 质粒DNA标准品噪声性聋 mtDNA4977 deletion
分类号: R764
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:构建实时定量PCR（Real- time PCR）的质粒标准品,为定量检测人类线粒体DNA ⁴⁹⁷⁷bp(mitochondrial DNA,mtDNA⁴⁹⁷⁷)缺失突变（简称普遍缺失）的拷贝数,为探讨线粒体mtDNA⁴⁹⁷⁷缺失突变与噪声性耳聋的关系奠定基础。方法:首先用PCR技术分别扩增人的线粒体mtDNA⁴⁹⁷⁷缺失片段CD、线粒体保守序列D-LOOP和人的管家基因GAPDH,琼脂糖凝胶电泳,胶回收DNA,纯化,将其分别连接到PMD19-T载体上,转化感受态细胞,挑选阳性克隆株大量扩增后提取质粒,通过酶切和测序检测目的片段的插入情况。同时对插入正确的的质粒一系列倍比梯度稀释进行实时定量PCR检测,通过其扩增曲线、标准曲线和扩增效率等判断评价构建的质粒标准品。结果:1.利用合成的引物扩增出人线粒体mtDNA⁴⁹⁷⁷缺失片段CD、线粒体保守序列D-LOOP和人的管家基因GAPDH 2.将CD、D-LOOP和GAPDH三个目的片段分别正确连接至PMD19-T载体上3.构建的质粒标准品经实时定量PCR检测,系列梯度稀释的标准曲线复孔间重复性好,特异性高,质粒标准品构建成功。结论:成功构建人类线粒体mtDNA⁴⁹⁷⁷缺失突变的标准品,为进一步在定量水平研究线粒体大片段缺失与噪声性耳聋的关系奠定了基础,提供了定量的新方法。

全文目录

中文摘要  5-7
Abstract  7-9
前言  9-11
材料和方法  11-17
  一、主要试剂  11
  二、主要仪器  11-12
  三、主要试剂的配制  12-13
  四、PCR引物和探针设计  13
  五、标准品质粒的构建  13-17
结果  17-22
讨论  22-24
参考文献  24-26
综述  26-34
  参考文献  31-34
英文缩略词简表  34-35
致谢  35

线粒体mtDNA4977缺失突变质粒标准品的构建

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