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鲤均一化全长cDNA文库构建、大规模测序及信息学分析

作　者: 徐茹
导　师: 孙效文
学　校:
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 鲤鱼均一化全长cDNA文库 测序 信息学分析 Rab 差异表达
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要


鲤鱼(Cyprinus carpio)，原产于欧亚大陆，是世界上重要的水产养殖鱼类。为进一步分析研究鲤鱼转录组数据及其功能基因，我们构建了鲤均一化全长cDNA文库。本研究以1龄雌性鲤鱼的八种组织为材料，包括血液、鳃、卵巢、肝胰脏、头肾、体肾、心和脑组织，利用Cap-trapper法，制备成全长Uncut cDNA原始文库。对原始文库进行检测，文库总克隆数（CFU）为6.4×106，重组率大于95%。采用基因组DNA饱和杂交原理，对文库进行均一化处理，从而构建了鲤鱼均一化的全长cDNA文库，CFU为2×105，重组率大于95%，插入片段平均长度大于1.0kb，全长比例大于90%。qPCR检测表明，文库均一化后，β-actin丰度相对于均一化前降低了87倍。对均一化后的文库随机挑取43008个克隆，利用M13F(-20)通用引物进行5’端测序，成功测序并得到29779条序列。序列处理后聚类拼接，获得15116条非重复序列（unigene），并提交至NCBI数据库。对得到的unigene进行长度分布及GC含量分析，序列长度主要分布在300bp-700bp间，平均长度为540bp；GC含量分析表明鲤鱼基因cDNA序列中GC含量为45.53％。基于本地Linux平台，使用BLASTX与无冗余蛋白数据库（NR）进行比对分析，对8437条序列进行了注释，包括分子功能、生物学过程和细胞组分三个层次,其中细胞组分分为13个部分，分子功能分为12个部分，生物学过程分为22个部分。从本文库筛选出3个Rab1a基因，分别为Rab1a-1、Rab1a-2和Rab1a-3。应用鲤BAC文库对Rab1a-1和Rab1a-2进行全长测序及信息学分析，绘制出基因结构图；随后，对它们的蛋白二级及三级结构进行比对作图，并构建系统发育树；最后，分析了Rab1a-1和Rab1a-2在不同组织的表达，以及低氧条件下它们表达的差异并对功能进行初步研究。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-8
第一章 文献综述  8-16
  1.1 鲤鱼全基因组研究进展  8
  1.2 cDNA 文库构建的研究进展  8-13
    1.2.1 cDNA 文库简介  8-9
    1.2.2 全长 cDNA 文库的构建方法  9-11
    1.2.3 均一化全长 cDNA 文库构建原理及方法  11-12
    1.2.4 均一化全长 cDNA 文库的应用  12-13
  1.3 表达序列标签（EST）及应用  13-14
    1.3.1 EST 概念和特点  13
    1.3.2 应用  13-14
  1.4 生物信息学技术及分析方法  14-16
    1.4.1 生物信息学简介  14
    1.4.2 生物信息学 EST 分析方法  14-16
第二章 鲤鱼均一化全长 cDNA 文库的构建以及大规模测序  16-32
  2.1 实验材料  16-18
    2.1.1 样品  16
    2.1.2 主要试剂及配制  16-17
    2.1.3 主要仪器设备及耗材  17-18
  2.2 实验方法  18-27
    2.2.1 鲤鱼 Total RNA 的提取  18
    2.2.2 mRNA 的分离  18-19
    2.2.3 全长 cDNA 文库的构建  19-24
    2.2.4 全长 cDNA 文库的构建文库质量鉴定  24
    2.2.5 均一化文库构建  24-26
    2.2.6 鲤鱼均一化全长 cDNA 文库测序  26-27
  2.3 结果与讨论  27-32
    2.3.1 鲤鱼总 RNA 的提取  27-28
    2.3.2 mRNA 的分离  28
    2.3.3 全长 cDNA 文库滴度检测及库容量计算  28-29
    2.3.4 全长 cDNA 文库的构建文库质量鉴定  29-30
    2.3.5 均一化文库构建  30-31
    2.3.6 鲤鱼均一化全长 cDNA 文库大规模测序  31-32
第三章 鲤鱼均一化全长 cDNA 文库 ESTs 序列生物信息学分析  32-36
  3.1 软件及使用方法  32-33
    3.1.1 文库测序数据预处理  32
    3.1.2 EST 功能注释  32-33
  3.2 结果与讨论  33-36
    3.2.1 ESTs 数据分析  33
    3.2.2 基于鲤鱼大规模 ESTs 数据长度分布及 GC 含量分析  33
    3.2.3 Unigene 的 GO 注释  33-34
    3.2.4 讨论  34-36
第四章 两个感兴趣基因的结构和功能生物信息学预测  36-44
  4.1 Rab 蛋白简述  36
  4.2 材料与方法  36-38
    4.2.1 实验材料  36-37
    4.2.2 RNA 提取及 cDNA 合成  37
    4.2.3 rab1a 基因的获取  37
    4.2.4 进化树分析  37
    4.2.5 基因表达 qRT-PCR 分析  37-38
  4.3 结果与讨论  38-44
    4.3.1 Rab1a 基因进化树分析  38-40
    4.3.2 Rab1a 基因序列分析  40
    4.3.3 Rab1a 蛋白分析  40-42
    4.3.4 Rab1a 差异表达分析  42-43
    4.3.5 讨论  43-44
参考文献  44-50
攻读硕士学位期间发表的学术论文  50-53
致谢  53

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产基础科学 > 水产生物学 > 水产动物学
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