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血浆DNA直接芯片PCR扩增和微流控化学发光SNP分析系统的研究

作　者: 宋侠
导　师: 吴志勇
学　校: 东北大学
专　业: 分析化学
关键词: 微流控芯片直接血浆PCR 焦磷酸测序 SNP 磁固定
分类号: R440
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

核酸是一类重要的生物分子,其分析一直受到人们的关注。核酸分析的发展离不开先进的分析仪器与技术,而仪器设备的微型化和集成化是一个日益明显的发展趋势,微全分析系统的提出和发展就是这一趋势的体现。血液是临床常用的检测样本,血浆DNA是血液细胞外的DNA,因为血浆DNA在疾病检测和预估方面的独特意义,近年来医学界对它的研究日益增多。本文在静态微池PCR芯片技术的基础上建立了血浆游离DNA的直接扩增方法；为了进一步对DNA进行分析,建立了微流控发光核酸分析系统,并初步用于核酸SNP位点的检测。基于血液直接扩增和芯片PCR研究,建立了静态微池PCR芯片上血浆DNA直接扩增方法。将λDNA(扩增片段为236bp)添加于血浆中,形成游离DNA模拟样品,通过改变PCR程序,优化反应体系,建立了直接血浆DNA扩增方法。该方法成功用于血浆中DYZ-1型基因(扩增片段为149bp)的直接扩增,以凝胶电泳作为检测手段,在25μL扩增反应体系中,发现血浆量在0.1-16.71μL之间均得到目标扩增产物。并在芯片上成功地进行λDNA和DYZ-1型基因的直接扩增,扩增结果分别用凝胶电泳和芯片毛细管电泳进行了检测。基于焦磷酸测序化学发光反应,利用磁定位固定方法在毛细管中制作了微反应器,建立了微流控发光分析系统。首先探讨了微反应器的制作,包括高梯度磁固定玻璃芯片、高梯度磁固定PDMS-ITO玻璃芯片和毛细管微反应器的制作。以毛细管作为试剂输运和发光反应的基本平台,永磁铁在毛细管两侧以相吸模式加磁固定磁珠模板,用磁屏蔽盒消除磁场对光电倍增管的可能干扰,建立微流控核酸发光分析系统。利用此系统,借助BAMPER法(结合修饰引物延伸反应的生物发光分析检测)对来自人血液的21号染色体rs8130833的SNP位点进行了检测。与基于静态发光反应的方法相比,该方法具有简单快速的特点。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-10
第1章绪论  10-24
  1.1 引言  10-11
  1.2 游离DNA概述  11-15
    1.2.1 血游离循环DNA在临床上的应用  11-13
    1.2.2 血游离DNA的检测方法  13-15
  1.3 血浆DNA的PCR扩增  15-18
    1.3.1 血浆游离循环DNA  15
    1.3.2 聚合酶链式反应  15-16
    1.3.3 直接血浆DNA扩增  16-17
    1.3.4 PCR芯片  17-18
  1.4 焦磷酸测序技术在微流发光核酸分析系统上的应用  18-22
    1.4.1 焦磷酸测序原理  18-19
    1.4.2 微流发光体系焦磷酸测序的发展  19-22
  1.5 本论文工作目的及设计思想  22-24
第2章血浆DNA在静态微池PCR芯片上的直接扩增  24-44
  2.1 引言  24-25
  2.2 实验部分  25-29
    2.2.1 样品和试剂  25
    2.2.2 仪器  25-26
    2.2.3 PCR反应体系  26-27
    2.2.4 PCR反应程序  27-28
    2.2.5 实验过程  28-29
  2.3 结果与讨论  29-42
    2.3.1 方法的建立  29-36
    2.3.2 本方法在实际样品上的应用  36-42
  2.4 小结  42-44
第3章微流控化学发光核酸分析系统的初步研究  44-62
  3.1 引言  44-45
  3.2 实验部分  45-54
    3.2.1 试剂与材料  45
    3.2.2 仪器与装置  45-46
    3.2.3 微流控发光体系的搭建  46-49
    3.2.4 磁珠的固定  49-50
    3.2.5 焦磷酸测序过程  50-53
    3.2.6 实验过程  53-54
  3.3 实验结果与讨论  54-60
    3.3.1 微流控芯片中的磁珠固定  54-55
    3.3.2 毛细管中的磁珠固定  55-57
    3.3.3 毛细管的三种加磁方式对焦磷酸测序反应信号的影响  57-59
    3.3.4 磁屏蔽盒的效果  59
    3.3.5 实际样品的SNP位点检测  59-60
  3.4 小结  60-62
第4章结论与展望  62-64
参考文献  64-74
致谢  74-76
攻读学位期间发表的论文  76

血浆DNA直接芯片PCR扩增和微流控化学发光SNP分析系统的研究

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