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柞蚕模式识别受体PGRP-A的序列分析及重组表达

作　者: 戴立上
导　师: 刘朝良
学　校: 安徽农业大学
专　业: 特种经济动物饲养
关键词: 柞蚕肽聚糖识别蛋白（PGRP） PGRP-A 基因克隆表达分析蛋白纯化
分类号: S885.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

昆虫的免疫系统与脊椎动物不同，它没有T细胞和B细胞，没有脊椎动物所具有的补体系统。尽管它没有获得性免疫系统，但是却具有可以对病原微生物做出快速和有效应答的先天性免疫系统。肽聚糖识别蛋白（PGRP）是重要的先天性免疫基因家族，是一种重要的模式识别受体，它可以识别微生物表面的肽聚糖（PGN)并启动免疫反应。迄今为止，在多种昆虫和其他动物中都发现了PGRP，尽管这些PGRP在进化过程中，结构上表现的很保守，但是在功能和表达模式方面确是不一样的。柞蚕（Antheraeapernyi）是鳞翅目大蚕蛾科柞蚕属的一种绢丝类昆虫，除了作为纺织工业原料利用外，还有很高的药用和食用等经济价值。为了能够更全面的了解PGRP在鳞翅目昆虫先天性免疫中的功能，本实验以柞蚕为研究对象，克隆鉴定出一种肽聚糖识别蛋白，将其命名为PGRP-A，利用分子生物学和生物信息学方法对柞蚕PGRP-A基因进行研究，获得的主要结果如下：1．PGRP-A基因的克隆及序列分析：设计简并性引物，经PCR克隆扩增获得了1个新基因PGRP-A的全长序列。该序列全长961bp，包括由40个核苷酸组成的5’端非编码区(5’UTR)、由582个核苷酸组成的开放阅读框(ORF)编码193个氨基酸，以及由339个核苷酸组成的3’端非编码区(3’UTR)。其中，编码氨基酸的预测分子量大小为22.0kDa，等电点为7.368。构建系统进化树分析表明柞蚕PGPR-A氨基酸序列与印度柞蚕PGRP的同源性最高。2.PGRP-A基因的表达分析：采用PCR方法扩增了柞蚕PGRP-A的ORF，并连接至表达载体pET-28a(+)，然后将重组质粒转入大肠杆菌Transetta（DE3）中，用不同浓度的IPTG进行诱导表达，经过SDS-PAGE和Westernblotting检测，结果表明重组蛋白在大肠杆菌中得到了稳定的表达，并用Ni-NTA亲和层析柱对重组蛋白进行纯化，为下一步研究其功能奠定了基础。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-7
1 文献综述  7-11
  1.1 昆虫的先天免疫  7
  1.2 模式识别受体  7-8
  1.3 肽聚糖识别蛋白研究进展  8-11
    1.3.1 肽聚糖识别蛋白  8
    1.3.2 肽聚糖识别蛋白的结构  8
    1.3.3 肽聚糖识别蛋白的组织分布  8-9
    1.3.4 肽聚糖识别蛋白的功能  9-11
2 引言  11-13
  2.1 研究的目的及意义  11
  2.2 主要研究内容  11-12
    2.2.1 柞蚕模式识别受体PGRP-A基因序列的测定  11
    2.2.2 柞蚕PGRP-A基因完整ORF的原核表达  11-12
  2.3 技术路线  12-13
3 材料与方法  13-24
  3.1 实验材料  13
  3.2 仪器与试剂  13-16
    3.2.1 主要实验仪器  13
    3.2.2 主要生化试剂  13-14
    3.2.3 常用溶液的配制  14-16
  3.3 实验方法  16-24
    3.3.1 柞蚕组织的收集  16
    3.3.2 柞蚕总RNA的提取  16
    3.3.3 提取的总RNA的质量检测  16
    3.3.4 第一链cDNA的合成  16-17
    3.3.5 柞蚕PGRP-A基因的全长cDNAPCR扩增  17-19
    3.3.6 PCR扩增后目的产物的纯化  19
    3.3.7 目的片段的连接和转化  19
    3.3.8 柞蚕PGRP-A基因序列的拼接与分析  19-20
    3.3.9 柞蚕PGRP-A蛋白完整ORF的原核表达  20-21
      3.3.9.1 柞蚕PGRP-A基因全长cDNA的扩增  20
      3.3.9.2 原核表达载体的构建  20-21
      3.3.9.3 重组蛋白的诱导表达  21
      3.3.9.4 SDS-PAGE电泳分析  21
    3.3.10 Westernblotting分析  21-22
    3.3.11 重组蛋白的大量诱导及纯化  22
      3.3.11.1 重组蛋白的可溶性分析  22
      3.3.11.2 重组蛋白的纯化  22
    3.3.12 柞蚕PGRP-A序列与氨基酸序列同源性分析和系统进化树构建  22-24
4 结果  24-30
  4.1 柞蚕总RNA的检测  24
  4.2 柞蚕PGRP-A基因序列的测定和分析  24-25
  4.3 柞蚕PGRP-A与其他昆虫PGRP的同源性分析  25-26
  4.4 原核表达载体的构建  26-28
    4.4.1 柞蚕PGRP-A全长ORF的扩增  26-27
    4.4.2 双酶切鉴定  27-28
  4.5 重组蛋白的原核表达及纯化  28-29
    4.5.1 IPTG不同浓度诱导的原核表达  28
    4.5.2 重组蛋白的纯化  28-29
  4.6 Westernblotting检测  29-30
5 讨论  30-31
  5.1 柞蚕蛹注射和柞蚕成虫注射的区别  30
  5.2 柞蚕PGRP-A基因全长与序列分析  30
  5.3 柞蚕PGRP-A的原核表达和WesternBlotting  30-31
6 结论  31-32
参考文献  32-36
致谢  36-37
个人简介  37
读研期间发表的论文  37

柞蚕模式识别受体PGRP-A的序列分析及重组表达

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