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杜仲叶提取物中绿原酸的纯化及其体外抑菌效果的研究

作　者: 伊文君
导　师: 武瑞
学　校: 黑龙江八一农垦大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 杜仲叶绿原酸絮凝沉淀大孔吸附树脂指纹图谱抑菌效果
分类号: S853.74
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

本研究旨在确定杜仲叶提取物中绿原酸的纯化工艺，并通过指纹图谱的建立对纯化产品的质量进行控制，继而考察其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、白色葡萄球菌、乳房链球菌、停乳链球菌的体外抑菌效果，为下一步临床应用提供试验依据。试验所采用的纯化方法是大孔吸附树脂法，首先通过絮凝沉淀法来对样品进行预处理，然后再用高效液相色谱法建立纯化绿原酸的指纹图谱；抑菌试验主要采用滤纸片法和连续梯度稀释法来观察并确定其抑菌效果和最小抑菌浓度；绿原酸的含量测定采用紫外分光光度和高效液相色谱两种方法。试验结果显示：絮凝沉淀的最佳工艺条件为，10mL pH=5的样品液中添加1%醋酸壳聚糖溶液1mL，在60℃的水浴中搅拌4min后，在4℃的环境中静置4h，过滤得到澄明度较好的样品溶液；NKA-Ⅱ树脂吸附与解析效果最好，其最佳工艺条件为，样品溶液pH=4，样品稀释倍数为6倍，上样体积为3.5BV，上样速度为2BV/h，洗脱剂为70%乙醇，洗脱速度为2BV/h，用量为2BV；纯化绿原酸的抑菌试验效果为，6种细菌的抑菌环直径分别为13.44、18.12、13.56、14.00、13.66、13.00mm，其中金黄色葡萄球菌高度敏感，其它5种细菌中度敏感；乳房链球菌、停乳链球菌的最低抑菌浓度为0.5g/mL，溶液中绿原酸含量为7.20mg/mL，其他4种细菌的最低抑菌浓度为0.25g/mL，溶液中绿原酸含量为3.58mg/mL；对照指纹图谱与每批样品的相似度均大于0.9，表明生成的对照指纹图谱可以代表10批样品的共同特征，可以作为本试验方法及条件下纯化绿原酸的指纹图谱。综上所述，絮凝沉淀法和大孔吸附树脂法的联用可以有效的分离纯化杜仲叶提取物中的绿原酸，纯化绿原酸可以通过指纹图谱控制质量，纯化绿原酸对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、乳房链球菌、停乳链球菌、蜡样芽胞杆菌、白色葡萄球菌均具有抑制作用。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-7
目录  7-11
第一章文献综述  11-19
  1.1 杜仲概述  11-12
    1.1.1 引言  11
    1.1.2 杜仲叶的化学成分  11-12
  1.2 绿原酸  12-16
    1.2.1 绿原酸的理化性质  12-13
    1.2.2 绿原酸的生物活性  13-14
    1.2.3 分离纯化方法  14-16
  1.3 指纹图谱  16-18
    1.3.1 概述  16-17
    1.3.2 中药指纹图谱建立的意义和原则  17-18
    1.3.3 中药指纹图谱的分类  18
  1.4 本研究的目的和意义  18-19
第二章杜仲叶提取物中绿原酸絮凝沉淀工艺的建立  19-27
  2.1 试验材料  19
    2.1.1 试验药品及试剂  19
    2.1.2 试验仪器  19
  2.2 试验方法  19-20
    2.2.1 絮凝剂添加量的筛选  19
    2.2.2 絮凝温度的筛选  19
    2.2.3 溶液搅拌时间对絮凝沉淀效果的影响  19-20
    2.2.4 pH 值对絮凝效果的影响  20
    2.2.5 絮凝试验正交试验设计  20
  2.3 结果与分析  20-23
    2.3.1 絮凝剂添加量的筛选  20-21
    2.3.2 絮凝温度的筛选  21
    2.3.3 溶液搅拌时间对絮凝沉淀效果的影响  21-22
    2.3.4 pH 值对絮凝效果的影响  22
    2.3.5 絮凝试验正交试验设计  22-23
  2.4 讨论  23-24
    2.4.1 絮凝剂添加量的筛选  23
    2.4.2 絮凝温度的筛选  23-24
    2.4.3 溶液搅拌时间对絮凝沉淀效果的影响  24
    2.4.4 pH 值对絮凝效果的影响  24
    2.4.5 絮凝试验正交试验设计  24
  2.5 小结  24-27
第三章大孔吸附树脂工艺的建立  27-39
  3.1 试验材料  27
    3.1.1 试验药品及试剂  27
    3.1.2 试验仪器  27
  3.2 试验方法  27-30
    3.2.1 紫外分光光度法建立绿原酸的标准曲线  27
    3.2.2 大孔吸附树脂的预处理  27-28
    3.2.3 大孔吸附树脂的筛选  28
    3.2.4 树脂 NKA-Ⅱ、XDA-Ⅰ静态吸附曲线的确定  28
    3.2.5 pH 值对吸附率的影响  28-29
    3.2.6 解析液的浓度对解析率的影响  29
    3.2.7 样品液浓度对吸附率的影响  29
    3.2.8 树脂上样体积的确定  29
    3.2.9 解析溶液体积对解析率的影响  29
    3.2.10 大孔吸附树脂正交试验  29-30
  3.3 结果与分析  30-35
    3.3.1 紫外分光光度法建立绿原酸的标准曲线  30
    3.3.2 大孔吸附树脂的筛选  30-32
    3.3.3 pH 值对吸附率的影响  32
    3.3.4 解析液的浓度对解析率的影响  32-33
    3.3.5 样品液浓度对吸附率的影响  33
    3.3.6 树脂上样体积的确定  33-34
    3.3.7 解析溶液体积对解析率的影响  34-35
    3.3.8 大孔吸附树脂正交试验  35
  3.4 讨论  35-37
    3.4.1 大孔吸附树脂的筛选  35-36
    3.4.2 pH 值对吸附率的影响  36
    3.4.3 解析液的浓度对解析率的影响  36
    3.4.4 样品液浓度对吸附率的影响  36-37
    3.4.5 树脂上样体积的确定  37
  3.5 小结  37-39
第四章杜仲叶绿原酸提取分离物抑菌效果的研究  39-45
  4.1 试验材料  39-40
    4.1.1 试验药品及试剂  39
    4.1.2 试验仪器  39
    4.1.3 试验菌株  39-40
  4.2 试验方法  40
    4.2.1 高效液相法检测绿原酸的含量  40
    4.2.2 纸片法测定杜仲叶绿原酸的抑菌作用  40
    4.2.3 杜仲叶绿原酸最低抑菌浓度的测定  40
  4.3 结果与分析  40-42
    4.3.1 高效液相色谱法绿原酸标准曲线的建立  40-41
    4.3.2 纸片法测定杜仲叶绿原酸的抑菌效果  41
    4.3.3 杜仲叶绿原酸最低抑菌浓度测定  41-42
  4.4 讨论  42-43
  4.5 小结  43-45
第五章杜仲叶绿原酸分离纯化物指纹图谱的建立  45-55
  5.1 试验材料  45
    5.1.1 试验药品及试剂  45
    5.1.2 试验仪器  45
  5.2 试验方法  45-47
    5.2.1 色谱条件  45
    5.2.2 样品溶液的制备  45-46
    5.2.3 对照品溶液的制备  46
    5.2.4 样品的测定  46
    5.2.5 指纹图谱及技术参数  46
    5.2.6 方法学考察  46-47
  5.3 结果及分析  47-53
    5.3.1 指纹图谱共有峰的标定  47-49
    5.3.2 样品共有峰相对面积与非共有峰面积  49-50
    5.3.3 10 批杜仲叶绿原酸分离物样品指纹图谱的相似度  50
    5.3.4 方法学考察  50-53
  5.4 讨论  53-54
  5.5 小结  54-55
第六章结论  55-57
附录  57-61
参考文献  61-67
致谢  67-69
个人简介  69

杜仲叶提取物中绿原酸的纯化及其体外抑菌效果的研究

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