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鸭疫里氏杆菌CH3的TbdR1缺失株构建

作　者: 卢凤英
导　师: 潘玲
学　校: 安徽农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 鸭疫里氏杆菌 TonB依赖受体获铁致病性缺失株
分类号: S855.12
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

鸭疫里氏杆菌病是由鸭疫里氏杆菌（Riemerellaanatipestifer，RA）引起鸭、鹅、火鸡和其他禽类的一种接触性传染病，最常见于鸭。鸭疫里氏杆菌病发病率高、死亡率高；即使耐受过病的鸭，也因此影响生长速度，甚至形成僵鸭，给养殖业造成巨大的经济损失。目前人们对RA的分子致病机制等还知之甚少。RA的GSM15868株的全基因组解析表明其基因组中含有31个编码TonB依赖受体的基因，且它们之间的同源性很低，提示它们可能在RA和宿主的相互作用过程中起着重要的作用。前期的研究表明，TonB依赖受体TbdR1是血清1型、2型和10型间的一种交叉免疫原性抗原。探究TbdR1的生物学功能对了解RA的分子致病机制十分有意义。本研究首先用基因克隆测序的方法分析了tbdR1基因在不同血清型RA中的分布和同源性，结果表明所有检测的RA菌株菌均携带tbdR1，且其氨基酸同源性高达98.2%－100%。其高度保守性提示该蛋白可能具有重要的生物学功能。其次，采用接合转移的方法将重组性自杀质粒pDS132-LSR导入RACH3株中，通过同源重组以1119bp的壮观霉素抗性基因替代tbdR1基因ORF中的2726bp片段，从而获得TbdR1的基因缺失株CH3ΔtbdR1。进一步将完整的TbdR1基因以及OmpA启动子克隆到E.coli－RA穿梭表达载体pRES上，并将其回复到CH3ΔtbdR1中，从而获得此缺失突变株的互补菌株cCH3ΔtbdR1。为了检验TbdR1基因在鸭疫里氏杆菌CH3株中，对于铁离子的吸收中是否起着重要的作用，用二吡啶(DIP)螯合培养基中的铁离子，比较了RA的野生CH3株、基因缺失株CH3ΔtbdR1和互补菌株cCH3ΔtbdR1在低铁环境下的的生长繁殖情况，并在上述的培养基中加入不同形式的铁离子（FeCl3或Hemin），研究TbdR1对CH3株获铁的影响；利用结晶紫染色的方法比较三株细菌的生物被膜形成能力是否具有差异；利用三株细菌黏附侵入Vero细胞的方法，比较它们对Vero细胞的黏附与侵入能力；用动物攻毒试验比较三株细菌的LD50，血液、肝脏和脑组织中的细菌载量，比较它们对雏鸭的致病性等方面的差异。结果表明，野生株CH3株和缺失株CH3ΔtbdR1在含200μmol/L铁离子螯合剂DIP的TSB中均不能生长繁殖；在上述培养基中添加FeCl3后，野生株CH3和互补菌株能生长，而缺失株仍然不能，提示TbdR1在CH3株获铁过程起着重要的作用。进一步的研究表明，TbdR1与CH3株获取Hemin有关。tbdR1缺失显著降低了CH3株的生物被膜形成能力，以及对Vero细胞的黏附和侵入能力。动物试验的结果显示，缺失株CH3ΔtbdR1对鸭的LD50比野生毒株CH3高45倍。另外，缺失株CH3ΔtbdR1在接种雏鸭后24h鸭血液、肝脏以及脑组织中的细菌载量与野生株相比显著下降（p＜0.01）。综上所述，研究的结果表明，TbdR1在鸭疫里氏杆菌CH3株的获铁（如hemin）过程中起着重要的作用，而且与CH3株的致病性相关。因此，TbdR1是鸭疫里氏杆菌的一个重要的毒力因子。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-8
插图与附表清单  8-9
主要符号表  9-10
文献综述  10-17
引言  17-18
1 材料与方法  18-26
  1.1 细菌菌株、动物及主要载体  18
  1.2 主要的酶、培养基及试剂  18-19
  1.3 主要仪器设备  19
  1.4 PCR引物  19-20
  1.5 不同血清型的RA的tbdR1基因检测以及同源性分析  20
  1.6 RACH3株TbdR1基因同源性左右臂及抗性片段的克隆  20-21
  1.7 重组质粒pT-tbdR1-LSR的构建  21-22
  1.8 自杀性重组质粒pDS-tbdR1-LSR的构建  22
  1.9 鸭疫里氏杆菌CH3株基因缺失株CH3△tbdR1的筛选及鉴定  22-23
  1.10 缺失株CH3△tbdR1的基因互补试验  23-24
  1.11 鸭疫里氏杆菌基因缺失株CH3△tbdR1的生物学特性研究  24-26
2 结果分析  26-38
  2.1 不同血清型的RATbdR1的检测及同源性分析  26-27
  2.2 RACH3株tbdR1基因同源性左右臂及抗性片段的克隆  27-28
  2.3 重组质粒pT-TbdR1-LSR的构建  28-29
  2.4 构建自杀性重组质粒pDS-TBDR1-LSR  29
  2.5 RA基因缺失株CH3△tbdR1的筛选及鉴定  29-31
  2.6 缺失株CH3△tbdR1的基因互补试验  31-32
  2.7 鸭疫里氏杆菌CH3△tbdR1基因缺失株的生物学特性  32-38
3 讨论  38-40
4 结论  40-41
参考文献  41-47
附录  47-51
致谢  51-52
作者简介  52

鸭疫里氏杆菌CH3的TbdR1缺失株构建

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