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鸡miRNA种子区多态位点筛选与miR-1657组织表达谱构建

作　者: 李红
导　师: 康相涛
学　校: 河南农业大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 鸡 miRNA 种子区单核苷酸多态性关联分析差异表达
分类号: S831
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

本研究的主要目的是筛选鸡 miRNAs种子区的SNPs，并分析其SNPs对鸡经济性状的影响，及miRNA在鸡的不同组织中的表达规律。本研究采用生物信息学方法筛选出鸡miRNAs种子区的SNPs。以河南省家禽资源创新工程研究中心构建的固始鸡-安卡鸡F2代资源群的860个基因组DNA为研究材料，结合混合DNA池和基因组测序及PCR-RFLP的方法筛选在资源群中存在的miRNAs种子区的SNPs，并与资源群体的肉质性状、生长性状和屠体性状等经济性状及血液生化指标进行关联性分析；同时进行了各突变位点对其显著相关性状的加性效应与显性效应研究，进而选择对群体表型性状有显著影响的miRNAs-seed-SNP。用荧光定量PCR检测目的miRNA与宿主基因在固始鸡的不同发育阶段不同组织中的特异性表达情况，并构建miRNA过表达载体，为miRNA的功能研究提供基础。本研究主要得到如下结果：1、结合在线软件预测及生物信息学分析，得到8个位于miRNAs种子区的突变。2、在固始鸡-安卡鸡F2代资源群体中检测到3个突变位点，分别是gga-miR-1644（+3T>C），gga-miR-1614-3p（+5G>A）和gga-miR-1657（+6G>A）。群体遗传学分析，显示+3T>C位点在该资源群中不属于多态位点（PIC<0.1）。gga-miR-1614-3p（+5G>A）和gga-miR-1657（+6G>A）与家系群体的肉质性状、生长性状和屠体性状等经济性状及血液生化指标的关联分析结果表明，+6G>A位点分别与家系2和8周体重，12周胫围，12周体斜长及4周骨盆宽及胸肌区域、胸肌纵横比、胸肌饱满度比率之间差异显著（P <0.05），与4、6、10、12周龄体重及胸肌长度之间差异极显著（P <0.01）。+5G>A位点只与肉质性状如胸肌剪切值、腿肌失水率（P <0.05）和腹脂重（P <0.01）显著相关，和屠体性状如翅重、肝脏重和心脏重显著相关（P <0.05）。+6G>A位点与体重和肉质性状及大部分的屠体性状的加性效应显著（P <0.05）。3、miR-1657及其宿主基因Rab38在固始鸡2周龄和36周龄不同组织中的差异表达分析结果表明： miR-1657在空肠、腺胃、大脑、心脏、肌胃、下丘脑、胸肌、和肺脏中的表达量2周龄显著高于36周龄（P <0.05），在下丘脑的相对表达量最高，组织特异性最强。宿主基因Rab38在肾脏中的表达量2周龄显著高于36周龄（P <0.05），而且Rab38在下丘脑、空肠、腺胃、心脏和腿肌中的表达趋势与miR-1657相同，由此推测miR-1657与其宿主基因Rab38可能存在共表达。4、本研究成功构建了鸡miR-1657的pcDNA3.1（+）-pre-miR-1657真核表达载体，为体外研究miR-1657的功能提供基础。

全文目录

致谢  4-10
摘要  10-11
1 文献综述  11-18
  1.1 miRNA 的研究进展  11-18
    1.1.1 miRNA 的生成与加工  11-12
    1.1.2 miRNA*的生物学意义  12-13
    1.1.3 miRNA 的命名  13
    1.1.4 miRNA 的特点  13
    1.1.5 miRNA 的生物学功能  13-15
    1.1.6 miRNA 多态性的研究  15-16
    1.1.7 miRNA 在家禽上的研究前景  16-17
    1.1.8 miRNA 相关的研究方法  17-18
2 引言  18-19
3 固始鸡-安卡鸡 F2代资源群 miRNA 种子区遗传变异的研究  19-38
  3.1 试验材料  19-21
    3.1.1 试验动物  19-20
    3.1.2 试验主要试剂及配制  20
    3.1.3. 主要仪器设备  20-21
  3.2 试验方法  21-23
    3.2.1 生物信息学预测  21
    3.2.2 SNP 的筛选引物  21
    3.2.3 PCR-RFLP 引物的设计  21-22
    3.2.4 建立最佳 PCR 反应条件  22
    3.2.5 PCR-RFLP 反应  22-23
  3.3 基因型的统计与分析  23
    3.3.1 基因型频率与基因频率的统计  23
    3.3.2 群体遗传多态性的分析  23
    3.3.3 突变位点基因型与经济性状的关联分析模型  23
  3.4 结果与分析  23-36
    3.4.1 鸡 miRNA 种子区 SNP 的筛选  23-24
    3.4.2 资源群 miRNA 种子区遗传变异检测  24
    3.4.3 鸡 miRNA 基因种子区 SNP 分型及测序鉴定  24-27
    3.4.4 miRNA 基因各突变位点基因型频率及基因频率统计  27
    3.4.5 鸡 miRNA 基因各突变位点的群体遗传学分析  27
    3.4.6 鸡 miRNA 种子区多态性与群体相关经济性状的关联分析  27-36
  3.5 讨论  36-37
  3.6 小结  37-38
4 miR-1657 和宿主基因 Rab38 在固始鸡的不同组织中的表达规律  38-45
  4.1 材料与方法  38-40
    4.1.1 试验动物  38
    4.1.2 试验试剂  38
    4.1.3 主要仪器  38
    4.1.4 荧光定量 PCR 引物设计  38-39
    4.1.5 反转录过程  39
    4.1.6 cDNA 质量的检测  39
    4.1.7 荧光定量 PCR 反应操作步骤  39-40
  4.2 实时定量数据分析  40
  4.3 结果与分析  40-44
    4.3.1 总 RNA 检测  40
    4.3.2 引物的特异性检测  40-42
    4.3.3 miRNA-1657 在固始鸡的不同组织中的表达情况  42
    4.3.4 miRNA-1657 宿主基因 Rab38 在固始鸡的不同组织中的表达情况  42-44
  4.4 讨论  44
  4.5 小结  44-45
5 鸡 miR-1657 基因过表达载体的构建  45-49
  5.1 试验材料  45
    5.1.1 质粒  45
    5.1.2 主要试剂  45
  5.2 方法  45-46
    5.2.1 PCR 引物设计与合成  45
    5.2.2 目的基因扩增  45-46
    5.2.3 连接反应  46
    5.2.4 转化反应  46
    5.2.5 pcDNA3.1(+)-miR-1657 载体的构建及鉴定  46
  5.3 结果  46-48
    5.3.1 目的基因的扩增  46
    5.3.2 菌液 PCR 检测  46-47
    5.3.3 重组质粒 pcDNA3.1(+)-miR-1657 的双酶切鉴定  47
    5.3.4 重组质粒 pcDNA3.1(+)-miR-1657 的测序鉴定  47-48
  5.4 讨论  48
  5.5 小结  48-49
6 全文总结  49-50
参考文献  50-56
ABSTRACT  56-58
个人简介  58

鸡miRNA种子区多态位点筛选与miR-1657组织表达谱构建

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