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混合体细胞滋养层对牛IVF胚胎培养的影响

作　者: 陈聪慧
导　师: 禹学礼
学　校: 河南科技大学
专　业: 农业推广
关键词: 牛 IVF 胚胎混合培养滋养层
分类号: S823
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

为探讨混合滋养层对牛的IVF 胚胎在体外发育的影响，本试验分别对胎鼠成纤维细胞、牛卵巢颗粒细胞、牛输卵管上皮细胞的培养方法进行了研究；同时，将三种细胞进行了混合培养后，再与牛IVF胚胎共培养，从而研究不同的共培养体系对牛IVF胚胎发育的影响作用。研究结果如下：1选择怀孕10.5d～17.5d的雌鼠，按试验分组(10.5-12.5d、13.5-14.5d、15.5-17.5d)分别获取不同胎龄胎鼠，同等条件下研究胎鼠成纤维细胞的最佳分离时间；分别用不用浓度（0.025％、0.05％、0.125％和0.25％）的胰蛋白酶于室温条件下对胎鼠组织进行消化，观察不同酶浓度对分离原代MEF的影响。结果表明：用胎龄13.5-14.5d的胎鼠来培养成纤维细胞效果最好；采用0.125％胰蛋白酶消化8-11min对细胞的损伤较小，传代之后细胞的生长速度较快。2在37℃条件下，将第3代颗粒细胞采用三种不同的消化方式进行消化传代：0.25％胰蛋白酶、0.02％EDTA、TE(0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA)混合进行消化传代，统计不同消化方式的细胞贴壁率；相同的条件下，分别采用刮取法、组织块法及消化法对输卵管进行处理，观察比较不同的获取方法对原代细胞培养的影响。结果表明，TE组细胞在12h和24h的贴壁率均高于其他两组（P<0.05），效果最好；通过刮取法获取的输卵管上皮细胞培养效果优于组织块法和消化法。3将胎鼠成纤维细胞、牛卵巢颗粒细胞和牛输卵管上皮细胞分别按照1:1的比例进行混合培养，研究混合培养细胞的贴壁率及台盼蓝染色鉴定其存活率。结果表明：GC-BOEC组在12h、24h的贴壁率及细胞活率都显著高于其他两组(P<0.05)。4将COCs经体外培养成熟后，按相同的方法进行体外受精，精卵共孵12h后随机将假定受精卵分别移入含有不同体细胞的培养体系中进行共培养（GC组、BOEC组、GC-BOEC组、对照组）。结果：各个实验组之间卵裂率无显著差异；GC-BOEC组的桑葚胚率（43.1％）显著高于其他三个试验组（P＜0.05），GC组与BOEC组之间差异不显著；GC-BOEC组的囊胚率（34.9％）显著高于GC组（30.6％）、BOEC组（27.1％）和无共培养组（3.4％）（P＜0.05），GC组与BOEC组之间差异不显著。结论：牛卵巢颗粒细胞与输卵管上皮细胞混合滋养层较之单一滋养层能更好地维持和促进牛早期胚胎的体外发育，可替代单一滋养层。

全文目录

摘要  2-4
ABSTRACT  4-10
文献综述  10-20
  1.1 哺乳动物早期胚胎在体内的形成过程  10-11
    1.1.1 精子在雌性生殖道内的运行  10
    1.1.2 卵子在生殖道内的运行  10
    1.1.3 配子在受精前的生理变化  10-11
    1.1.4 受精  11
    1.1.5 雌雄原核形成及融合  11
  1.2 哺乳动物的早期胚胎在体内发育的生理机制  11-12
    1.2.1 胚胎早期发育阶段输卵管的生理特点  11-12
  1.3 影响哺乳动物胚胎体外发育的因素  12-15
    1.3.1 胚胎自身对早期体外发育的影响  12
    1.3.2 培养液成分对早期体外发育的影响  12-14
    1.3.3 体外培养系统对早期体外发育的影响  14
    1.3.4 影响胚胎体外发育的其他因素  14-15
  1.4 体细胞的体外培养  15-16
    1.4.1 培养细胞的生物学特性  15-16
  1.5 IVF 胚胎与体细胞共培养的研究进展  16-20
    1.5.1 引发早期胚胎体外发育阻滞的因素  16
    1.5.2 共培养克服早期胚胎体外发育阻滞的可能机制  16-17
    1.5.3 IVF 胚胎与体细胞共培养的意义  17-18
    1.5.4 胚胎与体细胞共培养的研究进展  18
    1.5.5 混合体细胞滋养层与牛 IVF 胚胎共培养的研究  18-20
胎鼠成纤维细胞培养方法研究  20-27
  2.1 试验材料  20-22
    2.1.1 小鼠来源  20
    2.1.2 主要试剂和设备  20
    2.1.3 主要溶液的配制  20-22
  2.2 试验方法  22-24
    2.2.1 获取小鼠胚胎  22
    2.2.2 胎鼠成纤维细胞的原代培养（组织块培养法）  22
    2.2.3 胎鼠成纤维细胞的传代培养  22-23
    2.2.4 台盼蓝染色检测细胞活力  23
    2.2.5 试验设计  23-24
  2.3 试验结果  24-25
    2.3.1 不同胎龄胎鼠成纤维细胞的筛选  24-25
    2.3.2 不同胰酶消化液浓度对分离胎鼠 MEF 的影响  25
  2.4 讨论与结论  25-27
    2.4.1 不同胎龄胎鼠对 MEF 培养的影响  25-26
    2.4.2 不同胰酶消化液浓度对分离胎鼠 MEF 的影响  26-27
牛卵巢颗粒细胞及输卵管上皮细胞的培养  27-35
  3.1 试验材料  27-29
    3.1.1 卵巢来源  27
    3.1.2 输卵管来源  27
    3.1.3 主要试剂和设备  27
    3.1.4 主要溶液的配制  27-29
  3.2 试验方法  29-31
    3.2.1 牛卵巢颗粒细胞的采集及原代培养  29
    3.2.2 牛卵巢颗粒细胞的传代培养  29-30
    3.2.3 牛输卵管上皮细胞的原代培养  30
    3.2.4 牛输卵管上皮细胞的传代培养  30-31
    3.2.5 试验设计  31
  3.3 试验结果  31-33
    3.3.1 不同消化方式对颗粒细胞贴壁效果的影响  31-32
    3.3.2 原代不同方法获取输卵管上皮细胞的培养观察  32-33
  3.4 讨论与结论  33-35
    3.4.1 颗粒细胞生长状态观察  33
    3.4.2 不同消化方式对颗粒细胞贴壁效果的影响  33
    3.4.3 不同的获取方法对输卵管上皮细胞原代培养的影响  33-35
体细胞的混合培养研究  35-38
  4.1 试验材料  35
    4.1.1 小鼠来源、卵巢来源、输卵管来源  35
    4.1.2 主要试剂和设备  35
    4.1.3 主要溶液的配制  35
  4.2 试验方法  35-36
    4.2.1 胎鼠成纤维细胞、颗粒细胞及输卵管上皮细胞的原代、继代培养  35
    4.2.2 体细胞混合培养  35-36
    4.2.3 试验设计  36
  4.3 试验结果  36-37
    4.3.1 不同组合的混合培养细胞生长状况比较  36-37
  4.4 讨论  37-38
不同共培养体系对牛 IVF 胚胎发育的影响  38-46
  5.1 试验材料  38-40
    5.1.1 小鼠来源、卵巢来源、输卵管来源  38
    5.1.2 主要试剂和设备  38
    5.1.3 主要溶液的配制  38-40
  5.2 试验方法  40-42
    5.2.1 牛卵母细胞的采集  40
    5.2.2 牛卵母细胞成熟培养  40
    5.2.3 牛卵母细胞的成熟与评定  40
    5.2.4 精子的获能（上浮法）  40-41
    5.2.5 卵母细胞体外受精及早期胚胎的体外培养  41
    5.2.6 早期胚胎与胎鼠成纤维细胞共培养的方法  41
    5.2.7 颗粒细胞共培养方法  41
    5.2.8 输卵管上皮细胞共培养方法  41
    5.2.9 混合体细胞的培养及台盼蓝染色鉴定活力方法  41-42
    5.2.10 混合细胞滋养层与牛 IVF 胚胎共培养方法  42
    5.2.11 混合体细胞滋养层的制备  42
    5.2.12 统计分析  42
  5.3 试验结果  42-44
    5.3.1 不同共培养体系对牛 IVF 胚胎体外发育的影响  42-44
  5.4 讨论  44-46
    5.4.1 与体细胞共培养对牛 IVF 胚胎发育的影响  44-45
    5.4.2 体细胞混合培养体系对牛 IVF 胚胎发育的影响  45-46
结论  46-47
参考文献  47-53
致谢  53-54

混合体细胞滋养层对牛IVF胚胎培养的影响

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