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黄瓜苦味物质生物合成调控相关转录因子的筛选与鉴定

作　者: 张雷
导　师: 杨清；黄三文
学　校: 南京农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 黄瓜苦味合成转录因子筛选鉴定酵母单杂交
分类号: S642.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 27次
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内容摘要

黄瓜是一类重要的蔬菜作物,在世界上被广泛栽培。果实中积累葫芦素C会导致黄瓜苦味,严重影响黄瓜品质。从根本上真正解决黄瓜苦味问题,必须弄清楚黄瓜苦味形成的机制,才能为后续利用分子育种工具改良黄瓜品质打下坚实的科学基础。真核生物中,转录水平的调控是基因表达调控的主要方式。本研究使用黄瓜cDNA文库,通过酵母单杂交技术筛选与苦味物质生物合成调控相关的转录因子。主要结果如下：从华北型黄瓜9930中克隆苦味生物合成基因簇的启动子序列并构建到酵母单杂交报告载体pHIS2上。pHIlS2-BPr报告载体转化酵母Y187,获得能够消除报道基因在酵母细胞中的本底表达的最适3-AT浓度(15mM),此浓度作为后续筛选黄瓜cDNA文库的3-AT工作浓度。使用酵母单杂交技术,对黄瓜cDNA文库进行多次筛选,共鉴定出16个转录因子,其中有4个bHLH家族、4个bZIP家族、4个AP2/ERF家族、2个MYB家族和2个锌指蛋白。候选转录因子通过恢复验证及与p450氧化酶进行一对一的激活验证,筛选出的4个转录因子可以激活黄瓜苦味物质生物合成基因簇的表达,分别是Csa3G270(bHLH)、Csa6G020(bZIP)、Csa4G970(bZIP)和Csa5G220(bHLH).构建含有荧光素酶的报告载体和连有候选转录因子的效应载体,利用农杆菌渗透法直接转化烟草植株上的叶片,进行转录因子的瞬时表达分析。结果证明Csa3G270(bHLH)、Csa4G970(bZIP)和Csa5G220(bHLH)可以激活黄瓜苦味物质生物合成基因簇的表达。通过原核表达纯化系统,构建原核表达载体pET32a-Csa5G220,诱导纯化Csa5G220基因表达的融合蛋白。Csa5G220基因编码251个氨基酸的蛋白,相对分子量为33KDa,理论等电点为7.54。体外用凝胶阻滞试验进一步验证纯化蛋白与其顺式作用元件的结合能力。

全文目录

摘要  7-8
ABSTRACT  8-10
英文缩略表  10-11
第一章文献综述  11-23
  1 黄瓜苦味物质生物合成研究进展  11-12
  2 转录因子的结构与功能  12-14
    2.1 DNA结合区  13
    2.2 转录调控区  13
    2.3 核定位信号区  13-14
    2.4 寡聚化位点  14
  3 酵母单杂交系统  14-16
    3.1 酵母单杂交原理  14-15
    3.2 酵母单杂交在植物基因工程中的应用  15-16
  4 植物次生代谢物转录调控的研究进展  16-20
    4.1 MYB类转录因子  17-18
    4.2 bHLH类转录因子  18-19
    4.3 AP2/ERF类转录因子  19
    4.4 WRKY类转录因子  19-20
    4.5 NAC类转录因子  20
  5 本研究目的与意义及技术路线  20-23
    5.1 本研究目的与意义  20-22
    5.2 技术路线  22-23
第二章酵母单杂交报告载体pHIS2-BPr的构建  23-31
  1 材料与方法  23-28
    1.1 实验材料  23-24
    1.2 方法  24-28
      1.2.1 植株总DNA的提取  24
      1.2.2 Bi基因启动子区的PCR扩增  24-25
      1.2.3 目的片段的回收  25
      1.2.4 目的片段与载体连接  25-26
      1.2.5 质粒提取  26
      1.2.6 报告载体pHIS2-BPr的构建  26-27
      1.2.7 大肠杆菌的转化  27
      1.2.8 摸索最适3-AT浓度  27-28
  2 结果与分析  28-30
    2.1 报告载体pHIS2-BPr的构建  28-29
    2.2 摸索最适的3-AT浓度  29-30
  3 讨论  30-31
第三章与pHIS2-BPr互作的转录因子筛选与鉴定  31-45
  1 材料与方法  31-36
    1.1 实验材料  31
    1.2 方法  31-36
      1.2.1 黄瓜cDNA文库的扩增与检测  31-32
      1.2.2 酵母单杂交对照试验  32-33
      1.2.3 与pHIS2-BPr互作的转录因子筛选  33
      1.2.4 与pHIS2-BPr互作的转录因子分析  33-34
      1.2.5 与pHIS2-BPr互作的转录因子恢复验证  34-35
      1.2.6 黄瓜总RNA的提取与cDNA第一条的合成  35
      1.2.7 与pHIS2-BPr互作的转录因子构建全长验证  35
      1.2.8 pHIS2-p450报告载体的构建  35-36
      1.2.9 互作蛋白结合顺式作用元件的分析  36
  2 结果与分析  36-43
    2.1 cDNA文库的检测  36
    2.2 对照试验  36-37
    2.3 与pHIS2-BPr互作的转录因子  37
    2.4 pHIS2-p450报告载体的构建  37-38
    2.5 调控cluster的候选转录因子的构建与验证  38-41
    2.6 互作蛋白结合顺式作用元件的确定  41-43
  3 讨论  43-45
第四章候选转录因子瞬时表达分析  45-55
  1 材料与方法  45-49
    1.1 实验材料  45-46
    1.2 方法  46-49
      1.2.1 pCAMBIA1300-Luc报告载体的构建  46-47
      1.2.2 pCAMBIA1300-TF效应载体的构建  47-48
      1.2.3 农杆菌的转化  48
      1.2.4 烟草注射实验  48-49
  2 结果与分析  49-53
    2.1 pCAMBIA1300-Luc报告载体的构建  49
    2.2 pCAMBIA1300-TF效应载体的构建  49-50
    2.3 pCAMBIA1300-Luc和pCAMBIA1300-TF的农杆菌转化  50-51
    2.4 烟草注射实验  51-53
  3 讨论  53-55
第五章 Csa5G220基因原核表达分析  55-61
  1 材料与方法  55-58
    1.1 实验材料  55-56
    1.2 方法  56-58
      1.2.1 原核表达载体pET32a-Csa5G220的构建  56
      1.2.2 His-Tag融合蛋白的诱导表达  56-57
      1.2.3 His-Tag融合蛋白的纯化  57-58
  2 结果与分析  58-59
    2.1 原核表达载体pET32a-Csa5G220的构建  58
    2.2 Csa5G220-His融合蛋白的诱导表达  58
    2.3 Csa5G220-His融合蛋白纯化  58-59
  3 讨论  59-61
全文结论  61-63
参考文献  63-71
附录  71-75
致谢  75

黄瓜苦味物质生物合成调控相关转录因子的筛选与鉴定

内容摘要

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