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适宜茶园间作豆科植物的筛选

作　者: 汪强强
导　师: 张丽霞
学　校: 山东农业大学
专　业: 茶学
关键词: 茶园豆科植物氮素酶活性固氮菌
分类号: S571.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

本试验研究了四种豆科植物与茶树间作的氮素协调性、豆科植物的生长特性和根系结瘤特性，并利用无氮培养基从与茶树间作的豆科植物根系中分离纯化固氮细菌，对其进行分类筛选和鉴定，旨在筛选出适宜的茶园间作豆科植物。主要的研究内容及结果如下：（1）以不同生育时期豆科植物为材料，测定其硝酸还原酶（NR）和谷氨酰胺合成酶（GS）的活性，并以成年期豆科植物为材料，采用硝、铵氮素比为1:1的水培液测定其喜氮类型。结果表明，四种豆科植物的NR和GS活性因植物生育时期、器官而不同，它们之间的显著性也不同。四种豆科植物均有较强的喜硝特性，与喜铵的茶树间作具有氮素种类上的协调性。其中，以金达的总NR活性最高，GS活性最低，GS/NR值和吸氮量最小，最适宜茶园间作。（2）以豆科植物与福鼎大白成年茶树间作，观测豆科植物的生长和根瘤着生特性。结果表明，四种豆科植物与茶树根系吸收区在垂直分布上互补，也易形成密被的草甸，但紫花苜蓿根深分枝少，易与茶树形成养分竞争；长矛野豌豆也不适于间作。四种豆科植物根瘤的着生位置、色泽大致相同，但形状多样，重量上有显著性差异。（3）通过细菌固氮酶基因nifH克隆、全细胞蛋白电泳聚类分析、固氮酶活性测定筛选出4株高活性固氮菌，对其进行16SrDNA分子测序和生理生化特性测定，并结合负染电镜观察，参照《伯杰细菌鉴定手册》进行鉴定和生长特性的研究。结果表明，四株固氮菌分别为土壤杆菌（Agrobacterium viscosum）、丛毛单胞菌（Comamonas sp.）、成团肠杆菌（Enterobacteriaceae agglomerans）、产酸克雷伯克菌（Klebsiella oxytoca），其中，丛毛单胞菌为首次在植物根瘤中分离到该种属固氮菌；产酸克雷伯克菌（Klebsiellaoxytoca）固氮酶活性最高，达到37.82μmol·h-1·mL-1，与其他菌株存在极显著差异，也能利用试验所用的11种碳源，适生温度10-40℃，适生pH=4-10。（4）两种白三叶（铺地（Trifolium repens cv. PROP）和考拉（Trifolium repens cv.CLARE））均分离到固氮酶活性最高的产酸克雷伯克菌（Klebsiella oxytoca）；地被型紫花苜蓿（金达（Medicago sativa cv. KINDER））分离到的三株高活性固氮菌株：土壤杆菌（Agrobacterium viscosum）、丛毛单胞菌（Comamonas sp.）、成团肠杆菌（Enterobacteriaceae agglomerans），为分离菌株最多的植物；长矛野豌豆（Vicia sepiumLinn.）只分离到土壤杆菌（Agrobacterium viscosum），为分离效果较差的一种植物。可见，白三叶和紫花苜蓿在内生固氮菌株上具有相对的优势。

全文目录

中文摘要  9-11
Abstract  11-13
1. 前言  13-29
  1.1 选题背景  13-14
  1.2 相关研究进展  14-27
    1.2.1 茶园间作的研究进展  14-18
      1.2.1.1 茶园间作模式和间作物种类  14-16
      1.2.1.2 豆科植物在茶园间作中的应用现状  16
      1.2.1.3 茶园间作的生态效应  16-17
      1.2.1.4 山东茶区茶园间作的研究进展  17-18
    1.2.2 茶园氮素营养和利用的研究进展  18-20
      1.2.2.1 氮素对茶树的生理作用  18
      1.2.2.2 茶树对氮素的吸收特性  18-19
      1.2.2.3 茶园氮素与茶叶产量和品质的关系  19
      1.2.2.4 影响茶树氮素吸收的因素  19-20
      1.2.2.5 茶园氮素利用率的研究进展  20
    1.2.3 茶园微生物及固氮菌的研究进展  20-27
      1.2.3.1 茶园微生物的组成  20-21
      1.2.3.2 茶园微生物的影响因素  21-22
      1.2.3.3 茶园微生物的作用  22-23
      1.2.3.4 茶园固氮微生物  23-27
        1.2.3.4.1 固氮微生物概述  23
        1.2.3.4.2 豆科植物根瘤形成的基因调控  23-25
        1.2.3.4.3 茶园固氮微生物的研究进展  25-27
  1.3 本研究的目的意义、研究内容及技术路线  27-29
    1.3.1 目的意义  27
    1.3.2 研究内容  27-28
    1.3.3 技术路线  28-29
2 材料与方法  29-35
  2.1 实验材料  29
  2.2 设备与仪器  29
  2.3 实验设计  29-30
    2.3.1 豆科植物间作的氮素协调性研究  29-30
    2.3.2 豆科植物生长特性的研究  30
    2.3.3 豆科植物固氮性能的研究  30
  2.4 测定项目与方法  30-34
    2.4.1 豆科植物间作的氮素协调性研究  30-31
      2.4.1.1 豆科植物氮素喜氮类型  30
      2.4.1.2 豆科植物氮素代谢主要酶活性测定  30-31
    2.4.2 豆科植物生长特性及着生根瘤的调查  31
    2.4.3 根系内生固氮细菌的分离纯化  31-32
      2.4.3.1 培养基的制备  31
      2.4.3.2 细菌的分离纯化  31-32
    2.4.4 细菌基因组 DNA 的提取和检测  32
    2.4.5 固氮酶 nifH 基因的克隆和检测  32
    2.4.6 固氮细菌 SDS-PAGE 全细胞蛋白电泳分析  32
    2.4.7 固氮细菌固氮酶活性的测定  32-33
    2.4.8 高固氮酶活性菌株鉴定  33-34
      2.4.8.1 16SrDNA 分子鉴定  33
      2.4.8.2 细胞形态学特征鉴定  33-34
      2.4.8.3 生理生化特征鉴定  34
    2.4.9 固氮菌生长特性研究  34
      2.4.9.1 细菌的生长曲线的测定  34
      2.4.9.2 细菌对 pH 值和温度的响应曲线测定  34
  2.5 数据处理  34-35
3 结果与分析  35-51
  3.1 豆科植物间作的氮素协调性研究  35-38
    3.1.1 豆科植物喜氮类型  35-36
    3.1.2 豆科植物氮素代谢主要酶活性  36-38
      3.1.2.1 硝酸还原酶（NR）活性比较  36
      3.1.2.2 谷氨酰胺合成酶（GS）活性比较  36-37
      3.1.2.3 硝酸还原酶（NR）和谷氨酰胺合成酶（GS）活性比值  37-38
    3.1.3 豆科植物喜氮类型和氮素代谢主要酶活性之间的相关性  38
  3.2 豆科植物生长特性  38-40
    3.2.1 豆科植物根系和分枝数的动态变化  38-39
    3.2.2 豆科植物成年期生长指标调查  39-40
  3.3 豆科植物根瘤着生情况  40-41
  3.4 固氮菌的分离、纯化和 nifH 基因检测  41
  3.5 固氮细菌 SDS-PAGE 全细胞蛋白电泳分析  41-43
  3.6 固氮菌株的固氮酶活性比较  43-44
  3.7 固氮菌株的鉴定  44-48
    3.7.1 16SrDNA 分子鉴定  44-46
    3.7.2 形态学鉴定  46-47
    3.7.3 生理生化特性鉴定  47-48
      3.7.3.1 碳源利用特性  47
      3.7.3.2 细菌生化反应与需氧特性  47-48
  3.8 菌株的生长特性  48-51
    3.8.1 菌株的生长曲线  48-49
    3.8.2 菌株的 pH 值和温度响应曲线  49-51
4 讨论  51-56
  4.1 关于植物内生固氮菌的分离筛选和鉴定方法  51
  4.2 筛选菌株的种属特性和来源植物分析  51-52
  4.3 间作物的种类、生长特性与间作适宜性的讨论  52-53
  4.4 豆科植物喜氮类型、酶活性及适宜生育时期的讨论  53-55
  4.5 茶园间作豆科植物的筛选结果  55-56
5 结论  56-57
参考文献  57-69
致谢  69-70
攻读学位期间发表的学术论文目录  70

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