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秦艽和党参的休眠芽培养与玻璃化超低温保存研究

作　者: 张延红
导　师: 张金文
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 秦艽（Gentiana straminea Maxim.） 党参（Codonopsis pilosula (Franch.)Nannf.） 休眠芽 离体培养 玻璃化超低温保存 生理生化指标 细胞超微结构 遗传稳定性
分类号: S567.239
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


我国有中药资源12807种，其中药用植物11146种，占87.03%。目前处于濒危状态的药用植物近2100种，采用田间种植对数量繁多的种质资源进行保存，不仅在地力、人力、物力上有很大的压力，还易受自然灾害侵袭。20世纪70年代新发展起来的超低温保存技术，从理论上分析，生物材料在超低温条件下，其活细胞内的新陈代谢和生长活动几乎完全停止，是一种不需要继代可长期保存植物种质的有效方法。秦艽（Gentiana straminea Maxim.）和党参（Codonopsis pilosula(Franch.) Nannf.）是甘肃重要的道地药材，其中秦艽是国家重点保护的野生药材之一，党参为常用大宗药材。秦艽休眠芽大、含水量低，党参休眠芽小、含水量高，本研究以这两种类型的休眠芽为试验材料较为系统地研究了地下休眠芽的玻璃化超低温保存技术，为种类繁多的药用植物休眠芽超低温保存提供理论基础和技术支撑。通过本研究得出以下结论：1、以秦艽休眠芽作外植体进行离体培养的最佳初代培养基为MS+2.0mg/L6-BA+0.01mg/L NAA+3%蔗糖+0.7%琼脂；最佳继代培养基同初代培养基；最佳生根培养基为1/2MS（无机盐减半）+2mg/L IAA+0.5mg/LIBA+1.5%蔗糖。以党参休眠芽作外植体进行离体培养，最佳初代培养基为MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA。党参丛生芽最佳继代培养基为MS+0.2mg/L6-BA+0.05mg/L NAA；党参的最佳生根培养基为1/2MS（大量减半）+1.5mg/L IBA+1.5%蔗糖+0.2%活性炭。2、建立了秦艽休眠芽玻璃化超低温保存的技术体系：冻存时应采用经过寒冬锻炼且未萌动的休眠芽，以11、12和3月初的休眠芽为宜，先将5～10mm大小的芽在MS+0.7M蔗糖培养基上预培养3d，然后用2mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖溶液装载40min，再用PVS2处理60min后直接投入液氮。采用40℃水浴化冻2min，用含1.2mol/L蔗糖的MS无机盐培养液卸载20min，用无菌滤纸吸干芽表面的溶液后接种到恢复生长培养中（MS+0.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA），暗培养7d后转入正常光照培养，休眠芽冻存后的成活率高达100%。通过研究发现，取材季节、预培养方法、PVS2处理时间对超低温保存效果影响显著，是保存的关键性因素。PVS2处理温度、卸载时间、液氮保存时间等对冻存效果影响不显著。该技术体系在龙胆属不同种质资源中的通用性很高。3、建立了党参休眠芽玻璃化超低温保存的技术体系，将两年生的新鲜党参覆土后置于4℃低温锻炼90d左右，切取带少量根基和苞片的完整休眠芽，先用2mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖溶液装载20min，再用PVS2处理80min后直接投入液氮。采用40℃水浴化冻2min，用含1.2mol/L蔗糖的MS无机盐培养液卸载20min，用无菌滤纸吸干芽表面的溶液后接种到恢复生长培养中（MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/L NAA），于正常光照下培养，休眠芽冻存后的成活率达到74%。在党参玻璃化超低温保存时休眠芽的生理状态至关重要，较长时间的低温锻炼能够使冻存后芽的成活率显著升高，带有苞片及直接光照恢复培养有利于芽的成活。4、在秦艽和党参休眠芽超低温再生植株时可以采用与普通组培相同的丛生芽诱导、增殖和生根培养基及培养条件，冻存后休眠芽的发生途径通常不会因为超低温冷冻而发生改变，恢复生长时激素浓度和配比决定植株再生途径。5、通过测定秦艽休眠芽玻璃化超低温保存过程中的生理生化指标发现，PVS2时期可溶性糖含量和可溶性蛋白质含量较对照分别增加了2.4倍和1.8倍，恢复生长7d时可溶性糖和可溶性蛋白质含量急剧下降，显著低于对照。因此，休眠芽可能是通过提高体内可溶性糖和可溶性蛋白质的方式来应对玻璃化超低温保存过程中的逆境。脯氨酸含量较对照大幅降低。淀粉含量、POD和SOD酶活性在玻璃化超低温保存过程中变化不明显。其原因可能是休眠芽体内POD活性和SOD酶活性已足以抵御玻璃化超低温逆境。6、细胞中的内质网的形态随着超低温保存处理发生了一些变化，对照休眠芽细胞中内质网丰富且均为滑面内质网，玻璃化超低温保存处理过程中内质网分布广泛，也为滑面内质网，但内质网腔明显膨胀。恢复生长时期的内质网则为粗面内质网，其上附着了很多核糖体。在自然逆境和超低温逆境中细胞中的内质网都是通过类似的形态转变来应对的。在自然逆境条件下休眠芽细胞内含有很多前质体，在超低温保存过程中通过装载和PVS2处理，出现了淀粉粒同时伴随着前质体减少，化冻之后前质体又增多，未见淀粉粒。休眠芽细胞可能通过前质体和淀粉粒的相互转化来应对逆境。休眠芽是植物为了渡过不良环境形成的一种休眠器官，液泡数目很多，在进行预培养后液泡进一步增多，体积变小，其它超低温处理时期液泡数量仍很多。植物在自然条件下和人为提供的不良条件下，会采取相同的措施来应对逆境，即液泡的小型化发展是植物在进化过程中所形成的应对低温的主要机制。7、建立党参的ISSR-PCR最佳反应体系，为今后利用ISSR标记技术进行党参鉴定及种质遗传多样性分析提供一个标准化程序，即在25μL反应体系中，含有10×PCR Buffer缓冲液2.5μL， MgCl22.0mmol/L， dNTPs0.5mmol/L，引物0.4μmol/L，Taq DNA聚合酶1.0U，模板DNA为30ng；扩增程序为：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，采用引物的最佳退火温度退火1min，72℃延伸1.5min，共计35个循环，循环结束后在72℃延伸7min，4℃保存。利用该技术体系对党参超低温再生植株的遗传稳定性进行检测，变异率很低仅为1.1%，党参超低温再生植株具有较高的遗传稳定性。8、采用ISSR-PCR技术对秦艽超低温再生植株的遗传稳定性进行检测，未发现变异。

全文目录


摘要  7-10
Summary  10-14
缩略表  14-15
1 前言  15-27
  1.1 问题的提出  15-17
  1.2 前人研究进展  17-27
    1.2.1 休眠芽组织培养的现状及优势  17-18
    1.2.2 玻璃化超低温保存的概念、原理及其应用价值  18-19
    1.2.3 影响玻璃化法超低温保存的因素  19-25
      1.2.3.1 植物材料的生理状态  19
      1.2.3.2 保存材料大小  19-20
      1.2.3.3 植物的基因型  20
      1.2.3.4 植物材料的预处理  20-21
      1.2.3.5 装载(Loading)  21-22
      1.2.3.6 玻璃化(Vitrification)  22-23
      1.2.3.7 液氮冻存时间  23
      1.2.3.8 化冻与卸载  23-24
      1.2.3.9 恢复生长培养  24-25
    1.2.4 玻璃化超低温保存过程中的细胞超微结构变化  25
    1.2.5 超低温保存再生植株的遗传稳定性  25-27
  1.3 本研究的内容和创新点  27
2 秦艽和党参离体快繁体系的建立  27-41
  2.1 材料与方法  27-30
    2.1.1 试验材料  27-28
    2.1.2 试验方法  28-30
      2.1.2.1 秦艽休眠芽培养  28
      2.1.2.2 党参休眠芽和茎段的离体培养  28-29
      2.1.2.3 培养条件  29
      2.1.2.4 试管苗的驯化移栽  29-30
      2.1.2.5 试验统计方法  30
  2.2 结果与分析  30-39
    2.2.1 秦艽休眠芽培养  30-34
      2.2.1.1 无菌外植体的获得  30-31
      2.2.1.2 休眠芽的初代培养  31-33
      2.2.1.3 丛生芽的继代培养  33
      2.2.1.4 丛生芽的生根培养与驯化移栽  33-34
    2.2.2 党参的休眠芽培养  34-39
      2.2.2.1 无菌外植体的获得  34-35
      2.2.2.2 休眠芽和茎段的初代培养  35-36
      2.2.2.3 丛生芽的继代培养  36-37
      2.2.2.4 丛生芽的生根培养与驯化移栽  37-39
  2.3 小结  39-40
  2.4 讨论  40-41
3 秦艽和党参玻璃化超低温保存技术体系的建立  41-59
  3.1 材料与方法  41-42
    3.1.1 试验材料  41
    3.1.2 试验方法  41-42
      3.1.2.1 预培养和装载  41-42
      3.1.2.2 玻璃化液类型和处理时间  42
      3.1.2.3 化冻和恢复培养  42
      3.1.2.4 秦艽休眠芽玻璃化超低温保存技术体系的优化  42
      3.1.2.5 党参休眠芽玻璃化超低温保存技术体系的建立  42
  3.2 结果与分析  42-55
    3.2.1 秦艽休眠芽玻璃化超低温保存技术体系的建立  42-44
      3.2.1.1 玻璃化保护液类型对休眠芽成活率的影响  42-43
      3.2.1.2 玻璃化保护液处理时间对保存后成活率的影响  43
      3.2.1.3 休眠芽大小对成活率的影响  43-44
    3.2.2 秦艽休眠芽玻璃化超低温保存技术体系的优化  44-52
      3.2.2.1 预培养对休眠芽成活率的影响  44-45
      3.2.2.2 装载和 PVS2 处理时间对休眠芽冻存后成活率的影响  45-46
      3.2.2.3 PVS2 处理温度对休眠芽冻存后成活率的影响  46-47
      3.2.2.4 不同采材时期对超低温保存效果的影响  47
      3.2.2.5 化冻温度对秦艽休眠芽成活率的影响  47-48
      3.2.2.6 卸载时间对秦艽休眠芽成活率的影响  48-49
      3.2.2.7 暗培养时间对秦艽休眠芽超低温保存后成活率的影响  49
      3.2.2.8 液氮保存时间对秦艽休眠芽活力的影响  49-50
      3.2.2.9 各处理环节对休眠芽活力的损伤程度  50
      3.2.2.10 缺少超低温保存某环节对休眠芽成活率的影响  50-51
      3.2.2.11 不同种质的超低温保存  51
      3.2.2.12 恢复培养  51-52
    3.2.3 党参休眠芽玻璃化超低温保存技术体系的建立  52-55
      3.2.3.1 恢复培养时的光照条件对休眠芽成活率的影响  52-53
      3.2.3.2 苞片对休眠芽超低温保存效果的影响  53
      3.2.3.3 低温锻炼时间对休眠芽超低温保存效果的影响  53-54
      3.2.3.4 预培养方法对休眠芽超低温保存效果的影响  54-55
  3.3 小结  55-56
  3.4 讨论  56-59
4 秦艽休眠芽超低温保存过程中的生理生化指标变化  59-68
  4.1 材料与方法  59-60
    4.1.1 试验材料  59
    4.1.2 试验方法  59-60
      4.1.2.1 可溶性糖含量的测定  59
      4.1.2.2 淀粉含量测定  59-60
      4.1.2.3 可溶性蛋白质含量测定  60
      4.1.2.4 POD 酶活性测定  60
      4.1.2.5 SOD 酶活性测定  60
      4.1.2.6 脯氨酸含量测定  60
  4.2 结果与分析  60-66
    4.2.1 秦艽休眠芽超低温保存过程中的可溶性糖含量变化  60-61
    4.2.2 秦艽休眠芽超低温保存过程中的淀粉含量变化  61-62
    4.2.3 秦艽休眠芽超低温保存过程中的可溶性蛋白质含量变化  62-64
    4.2.4 秦艽休眠芽超低温保存过程中的脯氨酸含量变化  64-65
    4.2.5 秦艽休眠芽超低温保存过程中的 SOD 含量变化  65
    4.2.6 秦艽休眠芽超低温保存过程中的 POD 含量变化  65-66
  4.3 小结  66-67
  4.4 讨论  67-68
5 秦艽休眠芽超低温保存过程中的超微结构变化  68-74
  5.1 材料与方法  68-69
    5.1.1 试验材料  68-69
    5.1.2 试验方法  69
  5.2 结果与分析  69-71
    5.2.1 对照休眠芽茎尖的细胞超微结构  69
    5.2.2 预培养处理后休眠芽茎尖细胞的超微结构变化  69-70
    5.2.3 装载处理后休眠芽茎尖细胞的超微结构变化  70
    5.2.4 PVS2 处理后休眠芽茎尖细胞的超微结构变化  70
    5.2.5 化冻处理后休眠芽茎尖细胞的超微结构变化  70
    5.2.6 卸载处理后休眠芽茎尖细胞的超微结构变化  70
    5.2.7 恢复生长 2d 后休眠芽茎尖细胞的超微结构变化  70
    5.2.8 恢复生长 7d 后休眠芽茎尖细胞的超微结构变化  70-71
    5.2.9 直接投入液氮的休眠芽茎尖的细胞超微结构  71
  5.3 小结  71-72
  5.4 讨论  72-74
6 党参和秦艽休眠芽超低温保存再生植株的遗传稳定性  74-83
  6.1 材料与方法  74-75
    6.1.1 试验材料  74
    6.1.2 试验方法  74-75
      6.1.2.1 基因组 DNA 的提取及检测  74
      6.1.2.2 ISSR-PCR 体系的建立与优化  74
      6.1.2.3 产物的检测  74-75
      6.1.2.4 数据的采集、统计  75
  6.2 结果与分析  75-81
    6.2.1 DNA 的提取  75
    6.2.2 党参 ISSR-PCR 体系的建立  75-78
      6.2.2.1 退火温度对 ISSR 扩增的影响  75-76
      6.2.2.2 MgCl2浓度对 ISSR 扩增的影响  76
      6.2.2.3 dNTPs 浓度对 ISSR 扩增的影响  76-77
      6.2.2.4 引物浓度对 ISSR 扩增的影响  77
      6.2.2.5 Taq DNA 聚合酶对 ISSR 扩增的影响  77-78
      6.2.2.6 模板 DNA 用量对 ISSR 扩增的影响  78
    6.2.3 党参玻璃化超低温保存再生植株的遗传变异  78-80
      6.2.3.1 引物筛选  78-79
      6.2.3.2 党参超低温再生植株的 ISSR 分析  79-80
    6.2.4 秦艽 ISSR-PCR 体系的建立  80-81
  6.3 小结  81
  6.4 讨论  81-83
参考文献  83-95
附录  95-109
致谢  109-110
导师简介  110-111
作者简介  111-112

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 药用作物 > 草本 > 多年生 > 其他
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