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体外扩增过程中造血细胞生理状态和遗传稳定性研究

作　者: 葛剑云
导　师: 蔡海波
学　校: 华东理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 脐血造血干/祖细胞体外扩增细胞状态遗传稳定性
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

体外扩增技术是解决新鲜脐血中造血干/祖细胞数量稀少问题的有效策略,而扩增后细胞的质量和安全性是影响其临床应用的重要因素。本文以脐血CD34+细胞为对象,分别采用有或无血清培养体系,对体外培养细胞的生理状态、遗传稳定性、染色体核型和克隆形成能力进行了系统的分析,获得下列结果：(1)无论细胞培养基有无血清,细胞的比生长速率、S/G2/M期细胞比例、以及细胞内端粒酶活性均有相似的变化趋势,存在一定的相关性；(2)与CD34-细胞相比,在培养过程中CD34+细胞的凋亡率始终维持在较低水平上,低于新鲜分离的CD34+细胞中的凋亡率,表明CD34+细胞具有很强的抗凋亡特性；(3)在细胞培养过程中,与遗传稳定性相关基因Bmil、hTERT和Survivin mRNA的表达水平随培养时间延长均有不同程度的上调,但与K562细胞中的稳定高表达不同,提示细胞培养没有产生细胞恶化的信号;(4)6个脐血样本用含血清培养体系扩增,染色体核型异常比例较高,达2/3。但是这些异常的发生不具有定向性和稳定遗传性,且未表现出异常增殖的特征,提示有血清培养体系扩增的脐血造血干/祖细胞可能有临床安全性风险,但没有足够证据显示培养细胞出现了恶性转化。这些研究对确保培养细胞移植的安全性与有效性具有重要意义。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-10
第1章前言  10-21
  1.1 脐血造血干/祖细胞  10-11
  1.2 脐血造血干/祖细胞体外扩增  11-13
  1.3 体外扩增与细胞生理状态  13-16
    1.3.1 细胞周期分布  13-14
    1.3.2 细胞凋亡  14-15
    1.3.3 端粒酶活性  15-16
  1.4 扩增后细胞的遗传稳定性  16-20
    1.4.1 细胞恶性转化  17-18
    1.4.2 基因表达失调与细胞恶性转化  18-19
    1.4.3 染色体变异与细胞恶性转化  19-20
  1.5 本课题的意义和研究内容  20-21
第2章材料与方法  21-30
  2.1 实验仪器与设备  21
  2.2 实验材料与试剂  21-23
    2.2.1 脐血与脐血细胞分离  21
    2.2.2 培养基与血清  21
    2.2.3 细胞因子  21-22
    2.2.4 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂  22-23
    2.2.5 细胞周期检测试剂盒  23
    2.2.6 凋亡检测试剂盒  23
    2.2.7 端粒酶活性检测试剂盒  23
    2.2.8 染色体制备试剂  23
    2.2.9 其他试剂  23
  2.3 实验方法  23-30
    2.3.1 脐血造血干/祖细胞(CB CD34~+)的分离  23-24
    2.3.2 细胞计数和活率检测  24
    2.3.3 脐血造血干/祖细胞体外培养  24
    2.3.4 集落形成细胞分析  24-25
    2.3.5 细胞表型分析  25
    2.3.6 端粒酶活性检测  25
    2.3.7 细胞周期分析  25
    2.3.8 细胞凋亡分析  25-26
    2.3.9 染色体核型分析  26
    2.3.10 细胞中Bmil、hTERT和Survivin mRNA表达水平的检测  26-28
    2.3.11 CD34~+细胞中Bmil、hTERT和Survivin mRNA表达水平的检测  28-29
    2.3.12 软琼脂克隆实验  29
    2.3.13 统计学分析  29-30
第3章体外扩增过程中细胞生理状态的变化  30-50
  3.1 有血清培养体系中造血干/祖细胞扩增特性以及细胞生理状态的研究  30-40
    3.1.1 造血干/祖细胞体外扩增与生长动力学研究  30-34
    3.1.2 细胞周期分析  34-36
    3.1.3 细胞内端粒酶活性的变化  36-37
    3.1.4 细胞凋亡率的变化  37-40
    3.1.5 本节小结  40
  3.2 无血清培养体系中造血干/祖细胞扩增特性以及细胞生理状态的研究  40-47
    3.2.1 造血干/祖细胞体外扩增与生长动力学研究  40-43
    3.2.2 细胞周期分析  43-45
    3.2.3 细胞内端粒酶活性的变化  45
    3.2.4 细胞凋亡率的变化  45-47
    3.2.5 本节小结  47
  3.3 讨论  47-48
  3.4 本章小结  48-50
第4章体外扩增脐血造血干/祖细胞的遗传稳定性研究  50-64
  4.1 有血清培养过程中细胞的遗传稳定性研究  50-59
    4.1.1 扩增后细胞中Bmil、hTERT和Survivin mRNA的表达  50-51
    4.1.2 扩增后CD34~+细胞Bmil、hTERT和Survivin mRNA的表达  51-53
    4.1.3 扩增后细胞的染色体核型分析  53-56
    4.1.4 染色体核型异常与体外增殖的关系  56-57
    4.1.5 体外恶性转化实验  57-58
    4.1.6 本节小结  58-59
  4.2 无血清培养过程中细胞的遗传稳定性研究  59-62
    4.2.1 扩增后细胞中Bmil、hTERT和Survivin mRNA的表达  59-60
    4.2.2 扩增后CD34~+细胞中Bmil、hTERT和Survivin mRNA的表达  60-61
    4.2.3 本节小结  61-62
  4.3 讨论  62-63
  4.4 本章小结  63-64
第5章结论与展望  64-67
  5.1 全文总结  64-65
  5.2 展望  65-67
参考文献  67-75
致谢  75

体外扩增过程中造血细胞生理状态和遗传稳定性研究

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