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小麦谷氨酰胺合成酶在氮素代谢中的功能分析

作　者: 张同勋
导　师: 王小纯
学　校: 河南农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 小麦谷氨酰胺合成酶表达定位鉴定功能
分类号: S512.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

作物的氮素吸收、同化、转运以及氨基酸、蛋白质与核酸等含氮有机物合成是伴随作物生长发育的、与氮素利用密切相关的重要的氮素代谢过程。前人利用基因突变与过表达、QTL定位和植物生理学的方法证明谷氨酰胺合成酶(GS)及其活性与氮素利用及产量性状显著正相关；利用免疫组化、层析以及western-blot等细胞与生物化学技术阐明GS2定位于叶绿体及线粒体中,与氮素的同化相关；GS1定位于维管束组织的细胞液中,与氮素转移再利用相关,但在酶水平上尚未阐明不同的胞液GS同工酶在氮素代谢中的作用。我们利用native-PAGE结合活性染色技术首次从小麦中分离了4种迁移率和活性不同的GS同工酶,迁移率从大到小依次为GS2、GSx1、GSx2和GS1。需要对GS同工酶的亚基组成、亚细胞定位等进行鉴定,并从小麦生长发育的角度解析其在氮素吸收、同化及在转移过程中的作用。利用差速离心和密度离心技术纯化了小麦叶片的叶绿体和线粒体,native-PAGE结合活性染色及western blot研究表明迁移率最大、活性最高的GS2仅存在于叶绿体内,由45kD的亚基组成,是质体型GS。初步判定GSx1、GSx2和GS1存在于细胞液中。从Native-PAGE分别回收GS同工酶,利用western blot鉴定GS同工酶的亚基组成,结果表明GS1由38kD的亚基组成,是胞液型GS; GSx1由45kD的亚基组成,GSx2由38kD的亚基和45kD的亚基组成。依据western blot结果,利用MALDI-TOF-MS/MS对2-D胶中蛋白大小为45kD, pH为4.7-5.9范围内的蛋白点进行鉴定,结果显示为质体型GS,在38kD附近没有鉴定到胞液型GS,可能因为GS1蛋白的相对丰度较低。利用Native-PAGE结合SDS-PAGE分离纯化了38kD亚基,并采用LC-MS/MS方法对GS蛋白进行了鉴定,结果显示GSx1的蛋白序列和质体型GS2一致,GS1中的鉴定中出现了GS1、GSr1和GSr2三种蛋白小麦GS同工酶时空表达研究表明,在茎中,GS1活性在不同生长发育时期均处于主导地位,GS2,GSx1、GSx2仅在绿色茎中有较弱的表达；茎中含有丰富的维管束,主要起运输作用,进一步证明GS1与氮素转移有关。在叶片中,GS2活性在功能叶中处于主导地位,随着植株的衰老逐渐减弱直至消失。功能叶光合作用旺盛,叶绿体是光合作用和NO3-还原的场所,为氮素同化提供原料和能量,也证明GS2参与氮素同化。GS1在叶片的整个生长发育期均有较弱的活性,可能因叶片光合组织比输导组织发达之故。GS1将功能叶同化氮素向生长发育的器官运输,也将衰老叶片中含氮化合物降解释放的氨重新同化为谷氨酰胺再转运到籽粒等库器官中。GSx1仅存在于功能盛期的叶片中但活性很高,如开花期至花后14天的旗叶,功能盛期叶片光呼吸作用旺盛,推测其参与光呼吸释放氨的同化利用。GSx2仅存在于花后7天的叶片中且活性很弱,尚无法推测其功能。籽粒中只有GS1活性,在籽粒形成期活性很高,随后减弱；但其亚基组成却与茎叶中差异很大。开花后7d的籽粒GS1只有39kD大小的亚基；开花后14d检测到了39kD、43kD、45kD和49kD5种亚基；开花后21d和28d又多了33kD亚基。籽粒没有微管组织,GS1的功能尚无法确定。

全文目录

致谢  4-7
摘要  7-9
1 文献综述  9-15
  1.1 植物对氮素的吸收及利用  9-10
  1.2 高等植物GS/GOGAT对铵的同化作用  10
  1.3 高等植物GS分类及生理功能  10-13
  1.4 高等植物GS的表达调控  13-15
2 引言  15-17
3 材料与方法  17-20
  3.1 实验设计、试剂与仪器  17
    3.1.1 大田盆栽试验  17
    3.1.2 样品的采集和处理  17
    3.1.3 主要试剂  17
    3.1.4 主要仪器  17
  3.2 测定项目与方法  17-20
    3.2.1 粗酶液制备  17-18
    3.2.2 GS活性测定  18
    3.2.3 GS同工酶活性测定  18
    3.2.4 GS同工酶的Western-blot  18
    3.2.5 细胞器分离纯化  18
    3.2.6 GS蛋白纯化  18-19
    3.2.7 western-blotting  19
    3.2.8 2-D胶及MALDI-TOF-MS/MS  19
    3.2.9 LC-MS/MS  19-20
    3.2.10 免疫共沉淀  20
4 结果与分析  20-30
  4.1 GS的亚细胞定位  20-22
    4.1.1 鉴定小麦叶片叶绿体中GS同工酶  20-21
    4.1.2 鉴定小麦叶片线粒体中是否存在GS同工酶  21-22
  4.2 小麦GS同工酶的亚基组成鉴定  22-23
  4.3 2-D胶和MALDI-TOF-MS/MS分离及鉴定GS蛋白  23-28
    4.3.1 小麦叶片蛋白的2-D胶  23-24
    4.3.2 小麦叶片GS蛋白点的MALDI-TOF-MS/MS鉴定结果  24-25
    4.3.3 GS纯化蛋白双向电泳杂交结果  25-26
    4.3.4 利用LC-MS/MS鉴定GS蛋白  26-28
  4.4 小麦各生育时期GS酶活的时空变化  28-30
  4.5 不同时期籽粒GS亚基组成类型分析  30
5 结语与讨论  30-34
  5.1 GS同工酶的亚细胞定位  30-31
  5.2 谷氨酰胺合成酶的蛋白质鉴定  31-33
  5.3 GS蛋白的磷酸化调控  33
  5.4 GS同工酶的时空分布  33-34
参考文献  34-41
英文摘要  41-42

小麦谷氨酰胺合成酶在氮素代谢中的功能分析

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