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六种重要瓜类种传细菌可视基因芯片筛查及瓜类果斑病菌交叉引物扩增检测技术研究

作　者: 张靓
导　师: 刘凤权
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 种传细菌瓜类作物可视基因芯片交叉引物扩增技术检测
分类号: S436.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 35次
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内容摘要

瓜类作物在我国农业生产中占有举足轻重的地位。种传细菌是瓜类作物及健康种子生产中关注的重要对象,如西瓜嗜酸菌引起的瓜类果斑病,就是严重危害葫芦科作物的国际性检疫类病害,可在西瓜种植区造成大规模的经济损失。目前除瓜类果斑病菌外,其他瓜类种传细菌病害还没有快速可行的检测方法,亦无检测标准,严重影响了口岸检疫和疫情诊断的速度与效率。因此针对瓜类种传细菌病害建立快速灵敏且能同时检测多种目标病菌的检测技术显得尤为迫切。本论文分别以可视基因芯片和交叉引物扩增(cross-priming amplification, CPA)两项技术为平台,对重要瓜类种传细菌病害的病原物进行新型检测方法的研究。依靠这两种新型分子生物学实验技术建立的筛查、检测方法,可以为瓜类种传细菌的快速初筛及健康种子质量控制提供新手段。本文针对细菌性白枯病菌(Pseudomonas viridiflava, Pv)、细菌性角斑病菌(P.syringae pv. lachrymans, Psl)、丁香假单胞丁香致病变种(P. syringae pv. syringae,Pss)、瓜类果斑病菌(Acidovorax citrulli, Ac)、细菌性叶斑病菌(Xanthomonas cucurbitae, Xc)、甜瓜黄单胞菌(X. melonis, Xm)六种瓜类种传细菌,利用多重PCR扩增及可视芯片检测技术,建立了可视基因芯片筛查方法。本研究应用三对基于细菌DNA gyrase subunit B genes (gyrB)基因设计的属内通用引物,建立了扩增效率良好的多重PCR检测体系。芯片检测实验表明,以细菌纯培养液为模板,六种目标菌检测灵敏度分别为,Pv:4.0×104CFU/mL; Psl:1.0×103CFU/mL; Pss:2.0×103CFU/mL; Ac:4.5×103CFU/mL; Xm:3.0×104CFU/mL; Xc:2.0×104CFU/mL。该结果比传统的凝胶电泳检测普遍提高10倍。实验还对新方法在种子样品实体检测中的应用进行了初步研究,结果显示可以从人工模拟带菌的西瓜、甜瓜、黄瓜的种子样品及自然感染瓜类果斑病菌的西瓜种子上检测到目标细菌。在对29株来自不同种属的非目标细菌进行的特异性测试中,虽有8株细菌发生假阳性显色,但因其不是瓜类作物的致病菌,由此判断,在对瓜种进行检测的过程当中因以上非特异菌株导致结果呈阳性的可能性很小。与传统的凝胶电泳法检测PCR扩增产物相比,本研究建立的可视基因芯片检测法可以排除因扩增片段大小相似而导致的假阳性结果,具有高效、实用、高通量以及无需信号分析处理装置等优点,可以作为瓜类种传细菌病害的初筛手段进行应用。研究内容的第二部分介绍了瓜类果斑病菌交叉引物扩增检测方法的建立与初步应用。通过结合应用交叉引物扩增技术和胶体金检测试纸条,建立了一种具有快速方便、灵敏特异、不需昂贵仪器等优点的瓜类果斑病新型检测方法,能够高效地对葫芦科作物的带菌情况进行检测。DNA序列经过在恒温条件下特异性扩增后,便能够在一次性全封闭式靶核酸扩增物检测装置上直接观察到实验结果,整套操作过程只需提供离心机和简单的恒温设备。本研究(?)A. citrulli的16S rDNA序列区段设计了三条引物及两条探针。在针对菌悬液进行的灵敏度定量分析中,检测水平为3.7×103CFU/mL。在带菌种子的实体检测中,分别以人工模拟带菌和天然带菌的西瓜种子浸泡液中提取得到的DNA为模板,成功检测出瓜类果斑病菌,并且证实了种子样品检测的灵敏度为1.8×103CFU。本研究所建立的瓜类果斑病新型检测方法,将会有效弥补传统PCR、荧光定量PCR等技术在仪器不完善、人员技术水平有限的基层单位和农业生产一线无法应用的不足,因而具有极大的研究和推广价值。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-12
上篇文献综述  12-35
  第一章种传细菌病害检测方法及最新进展  13-23
    1 传统检测方法  13-15
      1.1 生理生化检测  14
      1.2 细菌噬菌体检测法  14-15
    2 分子生物学检测方法  15-23
      2.1 PCR技术  15-18
      2.2 实时荧光定量PCR  18-19
      2.3 血清学技术与PCR方法的结合  19
      2.4 基因芯片技术在口岸检疫应用上的展望  19-21
      2.5 CPA技术在植病检测领域的应用前景  21-23
  第二章六种重要瓜类种传细菌病害发生危害与识别  23-33
    1 瓜类果斑病菌  23-25
    2 细菌性角斑病菌  25-26
    3 细菌性叶枯病菌  26-27
    4 黄瓜细菌性白枯病菌  27-28
    5 丁香假单胞丁香致病变种  28-29
    6 甜瓜黄单胞菌  29-33
  第三章本项目的研究意义和解决目标  33-35
    1 研究意义  33
    2 研究目标  33-35
下篇研究报告  35-93
  第一章六种重要瓜类种传细菌可视基因芯片筛查方法研究  37-79
    摘要  37
    ABSTRACT  37-38
    1 材料与设备  38-42
      1.1 材料  38-42
      1.2 仪器设备  42
    2 方法  42-49
      2.1 实验菌株的活化及再纯化  42
      2.2 病原菌16S rDNA基因鉴定  42-43
      2.3 六种检测目标菌株的扩繁培养及计数  43
      2.4 引物及探针的设计  43-44
      2.5 PCR扩增及条件优化  44-45
      2.6 PCR扩增产物的凝胶电泳检测  45
      2.7 多重PCR反应特异性测试  45-46
      2.8 可视基因芯片上杂交位点的设计  46-47
      2.9 可视基因芯片检测方法的建立  47-48
      2.10 目标菌株的基因芯片检测特异性及灵敏度测试  48
      2.11 两种及两种以上目标细菌的同时检测  48
      2.12 瓜类种子的基因芯片检测  48-49
    3 结果与分析  49-68
      3.1 植物病原细菌16S rDNA、gyrB基因鉴定结果  49
      3.2 细菌的平板稀释计数法统计结果  49-50
      3.3 检测目标菌PCR反应特异性测试及退火温度条件优化  50-53
      3.4 目标菌多重PCR扩增产物凝胶电泳法检测灵敏度测试  53-54
      3.5 非目标菌的多重PCR特异性测试  54-55
      3.6 芯片的最适杂交温度  55-59
      3.7 可视芯片检测目标病原物的灵敏度测定  59-61
      3.8 两种或多种目标细菌同时检测结果  61-62
      3.9 可视芯片检测特异性测试  62-66
      3.10 带菌瓜类种子的实体检测  66-68
    4 讨论  68-77
    本章小结  77-79
  第二章瓜类果斑病菌交叉引物扩增检测技术研究  79-93
    摘要  79
    ABSTRACT  79-80
    1 材料与设备  80-82
      1.1 材料  80-82
      1.2 仪器装置  82
    2 方法  82-86
      2.1 实验菌株和梯度菌悬液的制备  82-83
      2.2 瓜类果斑病菌CPA法检测体系的建立  83-84
      2.3 常规PCR检测方法  84-85
      2.4 CPA法及常规PCR法检测结果的灵敏度比较  85
      2.5 CPA法的特异性检测  85
      2.6 CPA法检测种子样品  85-86
    3 结果与分析  86-89
      3.1 CPA法的特异性检测  86-87
      3.2 CPA法和PCR法检测结果的灵敏度比较  87-88
      3.3 CPA法检测带菌种子  88-89
    4 讨论  89-92
    本章小结  92-93
参考文献  93-101
致谢  101-103
攻读学位期间发表和待发表的论文目录  103

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