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棉铃虫细胞色素P450 CYP9A33与羧酸酯酶CXE6基因克隆与表达分析

作　者: 姬继超
导　师: 郭线茹
学　校: 河南农业大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 棉铃虫细胞色素P450 羧酸酯酶基因克隆原核表达 SDS-PAGE 蛋白质印迹
分类号: S435.622.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

棉铃虫Helicoverpa armigera为世界性农业害虫，危害多种经济作物。由于化学农药的大量使用，其对多种农药产生了抗药性。作为典型的鳞翅目夜蛾科昆虫，其嗅觉灵敏，成虫通过触角检测环境中的气味物质，以寻找寄主、配偶与产卵场所。气味物质通过其触角表皮进入感器腔道淋巴液，由气味结合蛋白运至嗅觉受体，随后在感器腔内或感器基部细胞中被相关酶降解，以使昆虫免遭环境气味物质的持续刺激。因此其阐明嗅觉信号失活机理，有利于寻找新的防治靶标位点。本研究以棉铃虫头部转录组数据为基础，采用基因拼接、BLAST、RT-PCR、RACE等手段从棉铃虫触角中克隆得到一条P450基因、一条羧酸酯酶基因，并采用荧光定量PCR技术研究了二者的时空表达情况，对P450基因进行了原核表达与Western blot检测，主要结果如下：（1）所得棉铃虫P450基因cDNA序列全长1772bp，命名为CYP9A33（GenBank登录号为JX486677），其开放阅读框全长1590bp，编码529个氨基酸残基，预测蛋白质分子量和等电点分别为61.62kD和7.97。氨基酸序列比对结果表明，CYP9A33与其他昆虫CYP9A亚家族序列一致性达60%以上，其中与甘蓝夜蛾Mamestra brassicae CYP9A13一致性最高，达75%。二者二级结构高度一致，6个底物识别位点（substrate recognition sites，SRSs）序列一致性达61%，底物与酶结合通道开关I螺旋中SRS4序列完全相同；CYP9A33编码蛋白中第25-529位氨基酸位于膜表面，2-24位氨基酸之间形成一个典型的跨膜螺旋。（2）CYP9A33在成虫各组织中均有表达，以腹部和头中表达量最高，且雌、雄蛾各组织间表达量均差异显著。在棉铃虫各个发育阶段也均表达，以雄蛹中的表达量最高，其次为雌蛹；在卵及各龄期幼虫中表达量均较低，且差异不显著；除刚羽化雄蛾和羽化后24h雌、雄蛾触角外，CYP9A33在其它日龄成虫触角中的表达量均显著高于幼虫与卵。（3）成功构建了CYP9A33基因部分片段融合表达载体，导入大肠杆菌BL21（DE3）细胞中，经过IPTG诱导以及SDS-PAGE和Western blot分析，结果表明融合蛋白得到了正确表达。（4）所得羧酸酯酶基因cDNA序列全长2002bp，命名为HaCXE6（Genbank登录号为JX306730）。其开放阅读框全长1623bp，编码540个氨基酸，预测其蛋白分子量为61.02kD，等电点为8.06；该基因预测氨基酸序列与海灰翅夜蛾Spodoptera littoralis触角羧酸酯酶CXE6的一致性最高，为68%；含有丝氨酸活性中心FGGDPSKVTTAGESYG和催化三聚体（Ser199，Glu323，His434）等羧酸酯酶保守结构域。系统发育树进化分析表明，昆虫亲缘关系越近，羧酸酯酶氨基酸序列一致性越高，同属夜蛾科的棉铃虫、海灰翅夜蛾、西非蛀茎夜蛾Sesamia nonagrioodes聚在一起。棉铃虫不同功能COEs序列关联性分析显示，HaCXE6与棉铃虫其他功能羧酸酯酶一致性很低，却独与气味降解酶CCE006a最先聚在一起，预测HaCXE6可能参与嗅觉相关功能。（5）实时荧光定量PCR显示HaCXE6在棉铃虫成虫各组织中均有表达，以雌蛾腹部与雄蛾足中表达量最高，且雌、雄蛾各组织间表达量均差异显著，腹部、足、触角等组织差异极显著水平。HaCXE6在棉铃虫不同发育阶段均有表达，其中以雄蛹期表达量最高，其次为雌蛹期；成虫期仅触角中表达量就显著高于各幼虫期整个虫体的表达水平。

全文目录

致谢  4-8
摘要  8-10
1 文献综述  10-26
  1.1 昆虫嗅觉器官  10-13
    1.1.1 触角  10-12
    1.1.2 下颚须/下唇须  12-13
  1.2 昆虫嗅觉  13-17
    1.2.1 昆虫嗅觉研究由来  13-14
    1.2.2 昆虫嗅觉分子机制  14-16
    1.2.3 蛾类与果蝇嗅觉异同  16-17
  1.3 嗅觉相关蛋白  17-26
    1.3.1 气味结合蛋白  17-19
    1.3.2 嗅觉受体蛋白  19-20
    1.3.3 气味受体共表达蛋白  20-21
    1.3.4 感觉神经元膜蛋白  21-22
    1.3.5 G 蛋白  22
    1.3.6 气味降解酶  22-26
2 引言  26-27
3 材料与方法  27-44
  3.1 供试材料  27-30
    3.1.1 供试昆虫  27
    3.1.2 菌种  27
    3.1.3 主要试剂  27
    3.1.4 培养基  27-28
    3.1.5 仪器设备  28
    3.1.6 试验中所用的主要溶液  28
    3.1.7 SDS-PAGE 电泳试剂  28-29
    3.1.8 Western blot 主要试剂  29-30
  3.2 试验方法  30-44
    3.2.1 棉铃虫 CYP9A33 基因克隆与原核表达  30-42
      3.2.1.1 CYP9A33 基因克隆  30-34
      3.2.1.2 CYP9A33 基因 3'RACE 扩增  34-35
      3.2.1.3 CYP9A33 基因 5'RACE 扩增  35-37
      3.2.1.4 CYP9A33 基因片段的原核表达与 Western blot 检测  37-40
      3.2.1.5 CYP9A33 基因时空表达定性分析  40-41
      3.2.1.6 CYP9A33 基因时空表达定量分析  41-42
      3.2.1.7 CYP9A33 序列分析  42
    3.2.2 棉铃虫 HaCXE6 基因克隆与表达分析  42-44
      3.2.2.1 HaCXE6 基因克隆  42
      3.2.2.2 HaCXE6 基因 3'RACE 扩增  42-43
      3.2.2.3 HaCXE6 基因 5'RACE 扩增  43
      3.2.2.4 HaCXE6 时空表达定性分析  43
      3.2.2.5 HaCXE6 时空表达定量分析  43
      3.2.2.6 HaCXE6 序列分析  43-44
4 结果与分析  44-59
  4.1 棉铃虫 CYP9A33 基因克隆与原核表达  44-49
    4.1.1 CYP9A33 基因克隆与序列分析  44
    4.1.2 CYP9A33 与其他昆虫 P450 序列比对  44
    4.1.3 CYP9A33 编码蛋白二级结构分析  44
    4.1.4 CYP9A33 基因时空表达定性分析  44-47
    4.1.5 CYP9A33 基因时空表达定量分析  47
    4.1.6 CYP9A33 原核表达与 Western blot 鉴定  47-49
  4.2 棉铃虫 HaCXE6 基因克隆与表达分析  49-59
    4.2.1 HaCXE6 基因克隆与序列分析  49
    4.2.2 HaCXE6 氨基酸序列分析与多重比对  49-50
    4.2.3 棉铃虫不同功能羧酸酯酶序列关联性分析  50-51
    4.2.4 HaCXE6 基因时空表达定性分析  51-52
    4.2.5 HaCXE6 基因时空表达定量分析  52-59
5.结论与讨论  59-63
  5.1 结论  59-60
  5.2 讨论  60-63
    5.2.1 细胞色素 P450  60-61
    5.2.2 羧酸酯酶  61-63
参考文献  63-74
ABSTRACT  74-76

棉铃虫细胞色素P450 CYP9A33与羧酸酯酶CXE6基因克隆与表达分析

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