枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一类广泛存在于自然界的对人类安全的生防细菌,对多种植物病原菌具有拮抗性,而且具有很强的环境适应性,能够产生耐热、抗逆的芽孢,有利于生防菌剂的生产、加工和储存,是一种理想的生防细菌。本论文以前期筛选到的生防" />

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生防菌B579发酵条件优化及生防效果的研究

作　者: 张艳春
导　师: 王敏
学　校: 天津科技大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 生防细菌枯草芽孢杆菌芽孢补料分批发酵两步控制促生长
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

芽孢杆菌的学位论文">枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一类广泛存在于自然界的对人类安全的生防细菌,对多种植物病原菌具有拮抗性,而且具有很强的环境适应性,能够产生耐热、抗逆的芽孢,有利于生防菌剂的生产、加工和储存,是一种理想的生防细菌。本论文以前期筛选到的生防细菌——枯草芽孢杆菌B579为研究对象,利用摇瓶发酵对枯草芽孢杆菌B579种子的培养进行了研究。以BYP培养基作为种子培养基,较佳的种子培养条件为：种龄14h,接种量7%。摇瓶发酵过程中最适pH为7.0。对枯草芽孢杆菌B579摇瓶发酵补料策略及补料量进行了优化,结果表明摇瓶发酵条件下葡萄糖反馈补料是最佳补料策略,在发酵的过程中控制葡萄糖浓度为3.0g/L-6.0g/L,发酵结束菌体浓度为9.5×109CFU/mL,为优化前的1.9倍。为了得到较优的芽孢生成条件,本论文采用LB培养基建立了两步发酵控制策略,在第一阶段(0-10h)促进菌体生长,第二阶段(10h-30h)促进芽孢生成。分别考察了培养基初始葡萄糖浓度、发酵过程pH、第二阶段摇床转速、第二阶段发酵温度对芽孢生成的影响。利用正交实验确定了获得高浓度芽孢的最佳发酵条件为：培养基初始葡萄糖浓度5.0g/L,发酵过程pH7.0,第一阶段的培养温度37℃,摇床转速180r/min,第二阶段发酵温度40℃,摇床转速为200r/min。此条件下发酵30h后获得的芽孢浓度为9.4×108CFU/mL,芽孢生成率为91.0%,分别是优化前的6.7倍和2.4倍。其中培养基初始葡萄糖浓度是影响芽孢生成的显著因素。在摇瓶发酵研究的基础上进行7L发酵罐分批发酵,在温度37℃,pH为7.0条件下,发酵30h,菌体浓度为1.1×1010CFU/mL。在温度37℃条件下,进行补料-分批发酵,发酵过程中调节pH维持在7.0,溶氧为10%左右,发酵过程中补加葡萄糖,使葡萄糖浓度保持在3.0-6.0g/L,发酵35h,菌体浓度达到了3.9×1010CFU/mL,是分批发酵菌体浓度的3.8倍。将优化后芽孢生成条件应用于7L发酵罐,发酵结束芽孢浓度达到了2.8×1010CFU/mL,芽孢生成率为75%。采用喷雾干燥法制备了枯草芽孢杆菌B579粉制剂,并利用杯碟法对其抑菌效果进行了比较。温室盆栽实验表明B579处理使黄瓜的出苗率提高了15%,苗期株高和鲜重分别增加了40%和30%,植株活力指数增加了49%,对黄瓜枯萎病的生防效果达73.6%,说明生防菌B579不仅可以有效抑制黄瓜枯萎病,而且对黄瓜植株有明显的促生长作用。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-10
1 前言  10-24
  1.1 土传病害  10-11
  1.2 生防细菌及其种类  11-12
    1.2.1 Bacillus属细菌  11
    1.2.2 Agrobacterium属细菌  11
    1.2.3 Pseudomonas属细菌  11-12
    1.2.4 Pasteurella属细菌  12
  1.3 芽孢杆菌的学位论文">枯草芽孢杆菌抑菌机理  12-17
    1.3.1 枯草芽孢杆菌的拮抗作用  12-16
    1.3.2 竞争和定殖作用  16
    1.3.3 诱导抗性  16
    1.3.4 促生长作用  16-17
  1.4 草芽孢杆菌作为生防因子的研发概况  17-18
    1.4.1 国外枯草芽孢杆菌的应用状况  17-18
    1.4.2 国内枯草芽孢杆菌的研究概况  18
  1.5 生防细菌发酵培养的研究  18-20
    1.5.1 发酵培养基的优化  18-19
    1.5.2 发酵条件的优化  19
    1.5.3 芽孢生成条件的优化  19-20
  1.6 枯草芽孢杆菌芽孢的生成  20-22
    1.6.1 芽孢的生成  20-21
    1.6.2 芽孢的结构  21
    1.6.3 芽孢的特性  21
    1.6.4 芽孢的用途  21-22
  1.7 课题研究背景及意义  22-23
  1.8 本论文的研究内容  23-24
2 实验材料与方法  24-36
  2.1 实验材料  24-26
    2.1.1 菌种  24
    2.1.2 培养基  24
    2.1.3 主要实验试剂  24-25
    2.1.4 主要实验仪器  25-26
  2.2 实验方法  26-30
    2.2.1 菌种培养方法  26
    2.2.2 枯草芽孢杆菌B579接种条件的优化  26-27
    2.2.3 枯草芽孢杆菌B579摇瓶发酵条件的优化  27
    2.2.4 枯草芽孢杆菌B579芽孢生成条件的优化  27-28
    2.2.5 金属离子对芽孢生成的影响  28-29
    2.2.6 发酵罐放大培养  29
    2.2.7 生防菌B579粉制剂的制备  29-30
    2.2.8 生防菌B579生防效果的研究  30
  2.3 分析方法  30-35
    2.3.1 菌体浓度的测定  30
    2.3.2 活菌总数的测定  30-31
    2.3.3 芽孢浓度的测定  31
    2.3.4 芽孢生成率  31
    2.3.5 pH仪测量发酵过程pH  31
    2.3.6 生物传感分析仪测量葡萄糖残糖  31
    2.3.7 总糖的测定-蒽酮比色法  31-33
    2.3.8 DNS法测发酵液中可溶性还原糖  33-34
    2.3.9 发酵液氨基氮的测定  34-35
    2.3.10 病情指数分析  35
  2.4 数据分析及统计  35-36
3 结果与讨论  36-57
  3.1 生防菌B579的菌体形态  36
  3.2 种子培养条件的优化  36-39
    3.2.1 种子培养基对生防菌B579发酵的影响  36-37
    3.2.2 接种量对生防菌B579生长的影响  37-38
    3.2.3 种龄对生防菌B579生长的影响  38-39
  3.3 生防菌B579摇瓶发酵过程分析  39-40
  3.4 生防菌B579摇瓶发酵条件的优化  40-44
    3.4.1 发酵过程中pH的确定  40-41
    3.4.2 摇瓶补料方式对生防菌B579发酵的影响  41-44
  3.5 枯草芽孢杆菌B579发酵过程中芽孢生成条件的优化  44-52
    3.5.1 枯草芽孢杆菌B579在LB培养基中的生长曲线  44-45
    3.5.2 通过两步控制策略优化芽孢生成条件  45-50
    3.5.3 金属离子对芽孢生成的影响  50-52
  3.6 发酵罐放大培养  52-54
    3.6.1 B579发酵罐分批发酵  52
    3.6.2 发酵罐补料分批发酵  52-53
    3.6.3 芽孢生成条件的发酵罐放大  53-54
  3.7 粉制剂活菌数的测定  54
  3.8 生防效果的测定  54-57
    3.8.1 平板对峙试验  54-55
    3.8.2 盆栽试验  55-57
4 结论  57-58
5 展望  58-59
6 参考文献  59-66
7 硕士期间发表论文  66-67
8 致谢  67

生防菌B579发酵条件优化及生防效果的研究

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