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鹅骨抗氧化肽的酶解工艺优化及其分离纯化的研究

作　者: 李娇娇
导　师: 李诚
学　校: 四川农业大学
专　业: 农产品加工及贮藏工程
关键词: 鹅骨蛋白酶解抗氧化活性分离纯化
分类号: TS251.94
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

本研究以鹅骨为原料,采用中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶6种蛋白酶对其进行酶解,以超氧阴离子自由基清除率为指标,选出三种较优酶。通过单因素实验和响应面分析法对单酶酶解鹅骨蛋白制备抗氧化肽的工艺进行优化,并在各个单酶最优酶解条件下进行双酶和三酶的复合酶解试验,比较单酶酶解、双酶酶解、三酶酶解对鹅骨蛋白的酶解效果,确定酶解鹅骨蛋白制备抗氧化肽的最优酶解工艺。在此基础上,对最佳酶解条件下的鹅骨蛋白酶解产物进行抗氧化活性研究。利用超滤、离子交换层析及凝胶过滤层析等分离纯化技术对最优酶解条件下的鹅骨蛋白酶解产物进行分离纯化,得到活性较高的鹅骨抗氧化肽。比较6种酶的酶解效果,选出风味蛋白酶、碱性蛋白酶及木瓜蛋白酶为较优酶,并对其酶解条件进行优化,得到各个酶的最优酶解条件。风味蛋白酶的最优酶解条件：酶底比8800U/g、温度50。C、pH6.0、酶解时间为8h、底物浓度为12g/100mL此时水解度为17.76%,超氧阴离子自由基清除率为64.14%。碱性蛋白酶的最优酶解条件：酶底比12000U/g、温度55℃、pH9.0、酶解时间为6h、底物浓度为12g/100mL。此时水解度为8.15%,超氧阴离子自由基清除率为63.98%。木瓜蛋白酶的最优酶解条件：酶底比12000U/g、温度69℃、pH5.5、酶解时间为4h、底物浓度为8g/100mL。此时水解度为11.27%,超氧阴离子自由基清除率为63.12%。比较单酶、双酶、三酶酶解效果,以超氧阴离子自由基清除率为指标,得到鹅骨抗氧化肽的最优酶解工艺为：在风味蛋白酶的最优酶解条件下酶解8h,再加入木瓜蛋白酶并在其最优酶解条件下酶解4h,此时超氧阴离子自由基清除率为67.94%,水解度为22.86%。在最优酶解条件下制备鹅骨蛋白酶解液,并对其体外抗氧化活性进行检测,结果表明：在酶解液浓度为10-50mg/mL范围内,酶解液对超氧阴离子自由基、羟基自由基和DPPH自由基都有一定的清除能力。超氧阴离子自由基清除率最高为60.80%,IC50值为28.02mg/mL；羟基自由基清除率最高为99.58%,IC50值为9.45mg/mL； DPPH自由基清除率最高为98.16%,并在浓度为30-50mg/mL范围内,酶解液清除能力稍高于Vc；酶解液还具有一定的还原能力。总之,对鹅骨蛋白酶解液采用不同的抗氧化活性检测方法结果表明酶解液具有一定的体外抗氧化活性。鹅骨蛋白酶解液经截留分子量为10KDa、5KDa的超滤管分离后,分为大于10KDa、5KDa-10KDa和小于5KDa三部分,其中分子量小于5KDa的超氧阴离子自由基清除率最高,并测得IC50值为7.93mg/mL。对超滤后小于5KDa的组分先采用离子交换层析分离,再进行凝胶过滤层析分离结果显示：鹅骨蛋白酶解产物经离子交换层析后被分为5个分离峰S1—S5,其中组分S2的超氧阴离子自由基清除率最高,经测定其IC50值为2.93mg/mL。组分S2经凝胶过滤层析分离后被分为3个分离峰S2A、S2B、S2C,其中组分S2B的超氧阴离子自由基清除率最高,经测定其IC50值为1.21mg/mL。对超滤后小于5KDa的组分先采用凝胶过滤层析分离,再进行离子交换层析分离结果显示：鹅骨蛋白酶解产物经凝胶过滤层析后有4个分离峰N1、N2、N3、N4,其中组分N3的超氧阴离子自由基清除率最高,经测定其IC50值为2.55mg/mL。组分N3经离子交换层析分离后被分为6个分离峰N3A、N3B、N3C、N3D、 N3E、N3F,其中组分N3B的超氧阴离子自由基清除率最高,经测定其IC50值为0.6mg/mL。比较两种分离方法对鹅骨蛋白酶解产物的分离效果,确定最佳分离方法为：对鹅骨蛋白酶解产物先进行超滤分离,再进行凝胶过滤层析分离,最后采用离子交换层析分离。分离得到抗氧化肽的超氧阴离子自由基清除能力较高,IC50为0.6mg/mL。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
1 文献综述  11-22
  1.1 立题背景及研究意义  11-12
  1.2 畜禽骨蛋白的研究进展  12-13
    1.2.1 畜禽骨蛋白概述  12
    1.2.2 国内外骨蛋白的研究现状  12-13
  1.3 抗氧化肽的研究进展  13-21
    1.3.1 抗氧化肽的制备  13-16
    1.3.2 抗氧化活性的检测方法  16-17
    1.3.3 抗氧化肽的分离纯化  17-21
  1.4 研究内容及目的  21-22
2 材料与方法  22-29
  2.1 材料与试剂  22
  2.2 仪器与设备  22
  2.3 实验方法  22-29
    2.3.1 鹅骨粉的制备  22-23
    2.3.2 鹅骨粉预处理条件  23
    2.3.3 鹅骨抗氧化肽的酶解工艺优化  23-26
    2.3.4 鹅骨蛋白酶解液的体外抗氧化活性研究  26
    2.3.5 鹅骨蛋白酶解液的分离  26-27
    2.3.6 指标测定  27-29
    2.3.7 数据处理及分析  29
3 结果与分析  29-58
  3.1 鲜鹅骨和鹅骨粉基本成分分析  29
  3.2 鹅骨粉预处理条件  29-30
    3.2.1 预处理温度确定  30
    3.2.2 高压处理时间确定  30
  3.3 鹅骨抗氧化肽的制备  30-48
    3.3.1 酶的选择  30-31
    3.3.2 风味蛋白酶最佳酶解工艺确定  31-36
    3.3.3 木瓜蛋白酶最佳酶解工艺确定  36-41
    3.3.4 碱性蛋白酶最佳酶解工艺确定  41-47
    3.3.5 单酶酶解与复合酶解酶解效果比较  47-48
  3.4 鹅骨蛋白酶解液的体外抗氧化活性  48-51
    3.4.1 鹅骨蛋白酶解液对超氧阴离子自由基的清除能力  48-49
    3.4.2 鹅骨蛋白酶解液对羟基自由基的清除能力  49-50
    3.4.3 鹅骨蛋白酶解液对DPPH自由基的清除能力  50
    3.4.4 鹅骨蛋白酶解液的还原能力  50-51
  3.5 鹅骨蛋白酶解液的分离纯化结果  51-58
    3.5.1 鹅骨蛋白酶解液的超滤分离结果  51-52
    3.5.2 分子量小于5KDa组分采用方法A进行分离结果  52-55
    3.5.3 分子量小于5KDa组分采用方法B进行分离结果  55-58
    3.5.4 鹅骨抗氧化肽最佳分离方法  58
4 讨论与结论  58-63
  4.1 讨论  58-61
    4.1.1 关于鹅骨粉酶解前的预处理  58
    4.1.2 关于鹅骨蛋白的酶解  58-59
    4.1.3 关于鹅骨蛋白酶解液的抗氧化活性  59-60
    4.1.4 关于鹅骨蛋白酶解产物的分离纯化  60-61
  4.2 结论  61-63
5 问题与展望  63-64
参考文献  64-71
致谢  71-72
攻读硕士期间发表文章  72

鹅骨抗氧化肽的酶解工艺优化及其分离纯化的研究

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