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枯草芽孢杆菌生产γ-聚谷氨酸过程中副产物积累和粗原料利用的研究

作　者: 朱凡
导　师: 岑沛霖；徐志南
学　校: 浙江大学
专　业: 生物化工
关键词: γ-聚谷氨酸 代谢分析 副产物 木质纤维素生物质发酵 分离纯化
分类号: TQ922
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
下　载: 7次
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内容摘要


γ-聚谷氨酸(Poly γ-glumatic acid,γ-PGA)是通过微生物合成的阴离子型均聚氨基酸。由于具有良好的生物相容性、生物降解性和高吸水性,γ-PGA及其衍生物可广泛用于食品、化妆品、医药和水处理等领域。目前通常采用微生物液体发酵实现γ-PGA的规模化生产,但在发酵后期发酵液黏度增加会导致产物积累的速率明显下降。本文首先采用气相色谱研究γ-PGA发酵过程中的主要代谢副产物,确定了2,3-丁二醇和3-羟基-2-丁酮为积累量最大的碳代谢副产物。然后在摇瓶发酵实验中考察了这两种副产物对细胞生长和γ-PGA合成的影响,结果显示,两种副产物对发酵不同阶段的细胞生长和产物合成都存在抑制作用。进一步研究了三种不同pH值下发酵过程中主要胞外代谢产物的积累情况,通过对γ-PGA相关碳代谢途径的代谢通量分析,发现最佳发酵过程pH值为6.5。在这一最适pH下,发酵代谢副产物积累总量最少,而细胞生物量、底物转化率和产物生成的速率均为最优。为了寻找经济价廉碳源,本文筛选获得了能够利用木糖和葡萄糖高效生产γ-PGA的枯草芽孢杆菌HB-1。该菌株能够以稀酸水解处理秸秆得到的六碳糖和五碳糖混合物为培养基碳源发酵生产γ-PGA,批次发酵结果表明该生产菌能够有效利用这一粗原料和前体谷氨酸,γ-PGA产量达到24.38g/L,并能通过流加秸秆水解糖将γ-PGA的产量提高到28.15g/L。最后,开展了发酵液微滤除菌、超滤浓缩、沉淀脱盐和喷雾干燥等工艺参数优化研究,确定了一条高效节能的中试工艺路线。本论文对微生物发酵生产γ-PGA的代谢过程、发酵工艺和分离纯化进行了深入研究,探索了副产物积累和粗原料利用等新的途径和工艺,具有应用于γ-PGA工业化生产的潜力。

全文目录


致谢  5-6
摘要  6-7
ABSTRACT  7-13
第一章 绪论  13-33
  1.1 引言  13
  1.2 γ-PGA的生产菌、合成途径及调控网络  13-22
    1.2.1 γ-PGA的来源  13-15
      1.2.1.1 γ-DL-PGA的生产者  14
      1.2.1.2 γ-D-PGA的生产者  14
      1.2.1.3 γ-PGA的生产者  14-15
    1.2.2 非核糖体的氨基酸聚合模式  15-18
      1.2.2.1 γ-PGA合成的硫模板机制  16-17
      1.2.2.2 γ-PGA合成的肽键连接机制  17-18
    1.2.3 生物合成γ-PGA的多酶复合体  18-20
      1.2.3.1 PgsB单位  19-20
      1.2.3.2 PgsC单位  20
      1.2.3.3 PgsA单位  20
      1.2.3.4 PgsE单位  20
    1.2.4 γ-PGA生物合成的调控网络  20-22
  1.3 微生物发酵生产γ-PGA及产物分离纯化  22-28
    1.3.1 培养基组分和培养条件对γ-PGA生产菌的影响  22-25
      1.3.1.1 碳源对发酵的影响  22-23
      1.3.1.2 氮源对发酵的影响  23-24
      1.3.1.3 金属离子对发酵的影响  24
      1.3.1.4 溶氧和pH值对发酵的影响  24
      1.3.1.5 补料发酵工艺  24-25
    1.3.2 改造基因工程菌生产γ-PGA  25
    1.3.3 产品的分离纯化  25-28
  1.4 γ-PGA产品的应用  28-31
    1.4.1 在医药领域的应用  28-29
    1.4.2 在工业领域的应用  29
    1.4.3 在农业领域的应用  29-31
      1.4.3.1 制备高吸水树脂  29-30
      1.4.3.2 作为缓释材料  30-31
      1.4.3.3 作为饲料添加剂  31
  1.5 本论文的研究思路和主要研究内容  31-33
第二章 实验材料与方法  33-42
  2.1 菌种  33
  2.2 仪器与试剂  33-35
    2.2.1 主要仪器  33-35
    2.2.2 主要试剂及标准  35
    2.2.3 膜分离设备组件  35
  2.3 培养基和培养方法  35-36
    2.3.1 培养基  35-36
      2.3.1.1 枯草杆菌ZJU-7培养基  35-36
      2.3.1.2 枯草杆菌HB-1培养基  36
    2.3.2 枯草杆菌培养方法  36
  2.4 产物y-PGA分离纯化方法  36-37
    2.4.1 发酵液微滤除菌  37
    2.4.2 微滤参数测定  37
    2.4.3 超滤浓缩、盐析和脱盐  37
    2.4.4 喷雾干燥  37
  2.5 分析测定方法  37-42
    2.5.1 CO_2和O_2在线测定  37-38
    2.5.2 pH值测定  38
    2.5.3 黏度测定  38
    2.5.4 生物量的测定  38-39
    2.5.5 葡萄糖和谷氨酸的测定  39
    2.5.6 木糖和还原总糖的测定  39-40
    2.5.7 γ-PGA的测定方法  40-42
      2.5.7.1 γ-PGA含量的粗测  40
      2.5.7.2 γ-PGA的酸水解测定  40
      2.5.7.3 γ-PGA的分子量测定  40-41
      2.5.7.4 枯草杆菌代谢副产物的测定  41
      2.5.7.5 料液离子强度测定  41-42
第三章 枯草杆菌产PGA过程中副产物积累的研究  42-53
  3.1 前言  42
  3.2 材料与方法  42-43
    3.2.1 菌株  42-43
    3.2.2 培养基  43
    3.2.3 培养方法  43
    3.2.4 分析测定方法  43
  3.3 实验结果与讨论  43-52
    3.3.1 流加发酵过程  43-44
    3.3.2 发酵主要副产物的测定  44-46
    3.3.3 发酵主要副产物的影响  46-49
      3.3.3.1 副产物对细胞生长的影响  46-48
      3.3.3.2 副产物对合成γ-PGA的影响  48-49
    3.3.4 不同pH值下发酵的副产物积累情况  49-52
  3.4 小结  52-53
第四章 枯草杆菌合成γ-PGA代谢网络模型和通量计算  53-65
  4.1 前言  53-54
  4.2 材料与方法  54
    4.2.1 菌株  54
    4.2.2 培养基  54
    4.2.3 培养方法  54
    4.2.4 分析测定方法  54
    4.2.5 代谢模型建立和通量计算方法  54
  4.3 实验结果与讨论  54-64
    4.3.1 枯草杆菌合成γ-PGA相关中心碳代谢网络模型的构建  54-58
    4.3.2 代谢通量计算  58
    4.3.3 不同pH值对代谢网络的影响  58-64
      4.3.3.1 实验测得的代谢流通量  59
      4.3.3.2 不同pH值对代谢通量分配的影响  59-61
      4.3.3.3 不同pH值下的能量代谢和细胞生物量变化  61-64
  4.4 小结  64-65
第五章 利用粗原料水解液发酵生产γ-PGA的研究  65-83
  5.1 前言  65
  5.2 材料与方法  65-68
    5.2.1 菌株  65
    5.2.2 培养基和培养方法  65-66
      5.2.2.1 培养基  65-66
      5.2.2.2 培养方法  66
    5.2.3 产物鉴定  66
    5.2.4 测定方法  66
    5.2.5 利用木糖生产γ-PGA菌株的筛选  66
    5.2.6 菌株的形态观察  66
    5.2.7 菌株16S rDNA扩增和鉴定  66-67
      5.2.7.1 细菌基因组DNA提  66-67
      5.2.7.2 16S rDNA扩增和测序  67
      5.2.7.3 序列分析比对  67
    5.2.8 木质纤维素废料水解方法  67-68
  5.3 实验结果与讨论  68-82
    5.3.1 菌种筛选结果  68
    5.3.2 产物鉴定结果  68-69
    5.3.3 菌种鉴定  69-70
      5.3.3.1 菌种形态特征  69
      5.3.3.2 菌种16S rDNA序列分析鉴定  69-70
    5.3.4 不同糖类碳源对枯草杆菌生长和γ-PGA产量的影响  70-71
    5.3.5 利用木糖发酵生产γ-PGA  71-74
      5.3.5.1 批次发酵实验  71-73
      5.3.5.2 流加发酵实验  73-74
    5.3.6 利用葡萄糖和模拟混合糖液批次发酵生产γ-PGA  74-77
      5.3.6.1 葡萄糖为主要碳源批次发酵  74-75
      5.3.6.2 模拟混合糖液为主要碳源批次发酵  75-77
    5.3.7 利用纤维质水解液批次发酵生产γ-PGA  77-80
      5.3.7.1 不同初始还原总糖浓度的影响  77-78
      5.3.7.2 纤维质水解液为碳源批次发酵  78-80
    5.3.8 不同碳源发酵生产γ-PGA的比较  80-82
  5.4 小结  82-83
第六章 γ-PGA分离纯化的中试放大研究  83-93
  6.1 前言  83
  6.2 材料与方法  83-84
    6.2.1 实验材料  83-84
      6.2.1.1 发酵液  83-84
      6.2.1.2 膜分离装置及组件  84
    6.2.2 微滤除菌  84
      6.2.2.1 不同稀释倍数的发酵液微滤除菌  84
      6.2.2.2 微滤参数测定  84
    6.2.3 超滤浓缩、脱盐和干燥  84
    6.2.4 分析测定方法  84
  6.3 实验结果与讨论  84-92
    6.3.1 微滤除菌中试实验研究  84-87
      6.3.1.1 发酵液pH值对微滤除菌的影响  84-86
      6.3.1.2 温度对微滤除菌的影响  86-87
    6.3.2 超滤最佳浓缩倍数的确定  87-89
    6.3.3 应用超滤法对γ-PGA沉淀脱盐  89-90
    6.3.4 喷雾干燥进口温度的影响  90-92
  6.4 小结  92-93
第七章 结论与展望  93-96
  7.1 主要结论  93-94
  7.2 展望  94-96
参考文献  96-109
攻读博士学位期间的科研成果  109

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 发酵法制氨基酸
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