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一种低温果胶酶的分离纯化及其酶学性质研究
作 者: 王大拓
导 师: 魏云林
学 校: 昆明理工大学
专 业: 生物化工
关键词: 低温果胶酶 分离纯化 酶学性质
分类号: TQ920.1
类 型: 硕士论文
年 份: 2009年
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内容摘要
从禄劝彝族苗族自治县轿子雪山的土壤中分离得到1株低温果胶酶生产菌株,经形态学、16S rRNA基因序列及生理生化特征分析,将其鉴定为解淀粉类芽孢杆菌,并命名为Paenibacillus amylolyticusP17,简称为P17菌株(GenBank登陆号为EU523226,发明专利申请的菌种保藏号为CGMCC No.2640)。实验表明,P17菌株的发酵条件(碳源、氮源、pH、温度及培养时间)经优化后,酶活力比优化前提高4.7倍。P17菌株在25℃发酵24 h后,发酵液经离心、超滤、盐析、离子交换层析后,获得电泳纯的低温果胶酶,命名为PNL-17。在纯化过程中酶比活力由38.1 U’mg-’提高到451.4 U·mg-1,提高了11倍,酶总收率为1.1%。酶学性质研究证明,PNL-17在O℃-50℃均具有较高的催化活力,其最适反应温度为40℃。酶的热稳定性较差,在50℃保温仅10 min酶活力就下降近80%。酶在pH 6.0-10.0之间稳定,最适催化pH为8.0。Mg2+、Zn2+、Cd2+等对酶有轻微的激活作用而Ca2+、Ba2+、pb2+等轻微抑制酶活,Hg2+对酶有显著的抑制作用。EDTA对酶有较为明显的抑制作用,表明酶对金属离子具有一定的依赖性。PNL-17对有机溶剂有良好的耐受性,经95%的甲醇、乙醇和丙酮溶液处理后,还分别保持61%、83%和86%的酶活力。采用SDS-PAGE和凝胶过滤法测定酶的相对分子质量,两者基本一致,约为22.4 KDa,为单体蛋白。PMSF对酶活没有抑制作用,基本证明酶的活性中心不含有丝氨酸残基。酶的催化活性随果胶酯化度的增加而增加,最适底物为90%酯化度的果胶,证明该酶属聚甲基半乳糖醛酸裂解酶。PNL-17在4℃的Km值(0.233mg·mL-1)远低于40℃的Km值(1.362 mg·mL-1),表明该酶在低温下与果胶的亲和力更大。在最适反应条件下酶的Vmax弘和Kcat值分别为54.505 mmol·min-1·L-1和7.44x102 S,其催化果胶的能力优于目前所报道的其它聚甲基半乳糖醛酸裂解酶。PNL-17的Ea值为33.9 KJ·mol-1,仅次于目前已知的另一低温果胶酶(Ea=28.7KJ·mol-1),也验证了PNL-17在低温下有较高的催化效率。PNL-17具有较好的低温催化活性及金属离子和有机溶剂耐受性,对高酯化度的果胶具有很高的催化效率。在食品、洗涤、纺织、制药、绿色化工、重金属污染废水处理等领域具有一定的应用潜力。
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全文目录
摘要 4-5 Abstract 5-11 插图和附表清单 11-13 缩略词 13-14 第一章 文献综述 14-29 1.1 果胶质研究简介 14-18 1.1.1 果胶质的分类 14-15 1.1.2 果胶质的制备 15-17 1.1.3 果胶质的应用 17-18 1.2 果胶酶研究简介 18-23 1.2.1 果胶酶的分类 18-21 1.2.2 果胶酶的分析方法 21-22 1.2.3 果胶酶的应用 22-23 1.3 低温果胶酶研究简介 23-27 1.3.1 产低温果胶酶的微生物 23-24 1.3.2 低温果胶酶的催化性质 24-26 1.3.3 低温果胶酶的应用前景 26-27 1.4 立题依据 27-29 第二章 低温果胶酶产生菌的筛选、鉴定及发酵条件优化 29-42 2.1 材料 29-30 2.1.1 采样点 29 2.1.2 培养基 29 2.1.3 试剂 29-30 2.2 方法 30-34 2.2.1 初筛 30 2.2.2 复筛 30 2.2.3 酶活力测定方法 30-32 2.2.4 P17菌株的形态观察 32 2.2.5 生理生化特征分析 32 2.2.6 16S rRNA基因序列分析 32-33 2.2.7 P17菌株的发酵条件优化研究 33-34 2.3 结果 34-41 2.3.1 初筛 34 2.3.2 复筛 34-35 2.3.3 半乳糖醛酸标准曲线的绘制 35 2.3.4 P17菌株的形态观察 35-36 2.3.5 生理生化特征分析 36 2.3.6 16S rRNA基因序列分析 36-37 2.3.7 P17菌株的发酵条件优化研究 37-41 2.4 小结与讨论 41-42 第三章 低温果胶酶的分离纯化 42-51 3.1 材料 42 3.1.1 菌种来源 42 3.1.2 培养基 42 3.1.3 试剂 42 3.2 方法 42-46 3.2.1 发酵液的制备 42 3.2.2 超滤浓缩 42-43 3.2.3 硫酸铵粗分级分离 43 3.2.4 酶的分离纯化 43-45 3.2.5 酶活力测定 45-46 3.2.6 蛋白质含量测定 46 3.2.7 酶的纯度鉴定 46 3.3 结果 46-49 3.3.1 牛血清白蛋白标准曲线的绘制 46-47 3.3.2 硫酸铵粗分级分离 47-48 3.3.3 酶的分离纯化 48-49 3.4 小结与讨论 49-51 第四章 PNL-17的酶学性质研究 51-69 4.1 材料 51 4.1.1 酶 51 4.1.2 试剂 51 4.2 方法 51-60 4.2.1 最适反应温度 51-52 4.2.2 最适催化pH 52 4.2.3 热稳定性 52-53 4.2.4 pH稳定性 53 4.2.5 金属离子耐受性 53-54 4.2.6 有机溶剂耐受性 54-55 4.2.7 抑制剂对酶活的影响 55 4.2.8 PNL-17相对分子质量的测定 55-57 4.2.9 底物特异性 57-58 4.2.10 酶促反应动力学研究 58-60 4.3 结果 60-67 4.3.1 最适反应温度 60 4.3.2 最适催化pH 60-61 4.3.3 热稳定性 61-62 4.3.4 pH稳定性 62 4.3.5 金属离子耐受性 62-63 4.3.6 有机溶剂耐受性 63 4.3.7 抑制剂对酶活的影响 63-64 4.3.8 PNL-17相对分子质量的测定 64-65 4.3.9 底物特异性 65-66 4.3.10 酶促反应动力学研究 66-67 4.4 小结与讨论 67-69 第五章 总结与展望 69-71 5.1 总结 69-70 5.2 展望 70-71 致谢 71-72 参考文献 72-78 附录A 攻读硕士期间发表论文目录 78-79 附录B 主要实验仪器 79
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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 一般性问题 > 基础理论
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