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泼尼松龙的微生物转化研究

作　者: 吴梦瑶
导　师: 崔励
学　校: 大连工业大学
专　业: 应用化学
关键词: 泼尼松龙微生物转化工艺研究分离纯化结构鉴定
分类号: TQ460.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

泼尼松龙(11β,17α,21-三羟基孕甾-1,4-二烯-3,20-酮)是一种重要的甾体化合物，以泼尼松龙为前体物质经化学合成法可以制得曲安奈德(Triamcinolone)、布地奈德(Budesonide)、环索奈德(Ciclesonide)和地索奈德(Desonide)等奈德类药物，这四种药物为治疗哮喘病的主要药物,市场潜力巨大。但上述药物的化学合成方法均有步骤复杂、副产物较多，成本高等缺点，对工业化生产带来较多不便，因此研究泼尼松龙的微生物转化十分必要。本论文选用4株链霉菌为泼尼松龙的主要转化菌株，对菌株的转化能力、泼尼松龙的微生物转化工艺、分离提纯方法等进行研究，主要内容及成果如下：1.通过紫外扫描确定底物吸收波长为245nm，根据底物和产物的特性对TLC和HPLC检测条件进行优化，确定底物和产物的定性定量分析方法。2.以WM-3和WM-4为出发菌株，得到相同的泼尼松龙转化产物WMFP。以WM-4为研究对象，考察碳氮源、接种时间、底物浓度及添加时间等条件对转化的影响，结果表明：种子培养基在24h达到对数期，其后接入发酵培养基可有效抵制底物对菌株的抗性，底物浓度在2.5mg/mL、添加时间在24h，以乙醇作为助溶剂，同时结合诱变作用以及底物抗性筛选，转化率可达到70%以上。柱层析法分离纯化产物WMFP，通过质谱和核磁进行鉴定，其结构为11β,17α,20,21-四羟基孕甾-1,4-二烯-3-酮，分子量为362。3.以WM-1和WM-2为出发菌株，得到产物均为16α羟基泼尼松龙和WMFP。以WM-1为研究对象，考察碳氮源、底物浓度及添加时间、溶氧量以及助溶剂等因素对转化的影响，结果显示底物浓度在2mg/mL，底物添加时间在26h，以聚乙二醇为助溶剂结合诱变作用，16α羟基泼尼松龙的转化率可达到5%。4.以泼尼松龙为底物经微生物发酵生产WMFP的方法文献中未见报道。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
第一章前言  10-20
  1.1 甾体类药物与微生物转化概述  10-12
  1.2 微生物转化甾体化合物的特点  12-14
  1.3 微生物转化甾体的方法  14-15
  1.4 微生物对甾体转化的反应类型  15-16
  1.5 其他一些重要的微生物转化反应  16-18
  1.6 立题依据  18-20
第二章泼尼松龙转化菌株的筛选  20-30
  2.1 实验材料  20-22
    2.1.1 仪器与设备  20
    2.1.2 药品及试剂  20-21
    2.1.3 底物  21
    2.1.4 培养基  21
    2.1.5 菌种  21-22
  2.2 实验方法  22-23
    2.2.1 斜面菌株制备  22
    2.2.2 发酵操作流程  22-23
    2.2.3 HPLC 检测  23
  2.3 结果与讨论  23-29
    2.3.1 HPLC 检测结果  23-25
    2.3.2 菌株 WM-4 转化泼尼松龙 HPLC  25-26
    2.3.3 菌株 WM-3 转化泼尼松龙 HPLC  26-27
    2.3.4 菌株 WM-1 转化泼尼松龙 HPLC  27-28
    2.3.5 菌株 WM-2 转化泼尼松龙 HPLC  28-29
  2.4 小结  29-30
第三章菌株 WM-4 转化泼尼松龙的研究  30-48
  3.1 实验材料  30
    3.1.1 仪器与设备  30
    3.1.2 药品与试剂  30
  3.2 实验方法  30-34
    3.2.1 检测方法  30-31
    3.2.2 种子最佳种龄的测定  31
    3.2.3 培养基优化  31
    3.2.4 诱变对转化的影响  31-32
    3.2.5 底物的抗性实验  32
    3.2.6 底物浓度对转化的影响  32
    3.2.7 底物加入时间对转化的影响  32
    3.2.8 溶氧量对转化的影响  32-33
    3.2.9 助溶剂对转化的影响  33
    3.2.10 金属离子对转化的影响  33
    3.2.11 产物的分离纯化方法  33-34
    3.2.12 硅胶柱层析方法  34
  3.3 结果与讨论  34-47
    3.3.1 WM-4 发酵产物的检测方法  34-35
    3.3.2 菌株 WM-4 种龄的测定  35
    3.3.3 培养基条件优化  35-38
    3.3.4 菌株 WM-4 的诱变转化  38
    3.3.5 底物的抗性实验  38-39
    3.3.6 底物浓度对转化影响  39-40
    3.3.7 底物加入时间对转化影响  40-41
    3.3.8 溶氧量对转化影响  41
    3.3.9 助溶剂对转化影响  41-42
    3.3.10 金属离子对转化影响  42-43
    3.3.11 WMFP 的分离纯化  43-44
    3.3.12 WMFP 的硅胶柱层析  44-47
  3.4 小结  47-48
第四章菌株 WM-1 转化泼尼松龙的研究  48-56
  4.1 实验材料  48
    4.1.1 仪器与设备  48
    4.1.2 药品与试剂  48
  4.2 实验方法  48-49
    4.2.1 种子最佳种龄的测定  48
    4.2.2 转化培养基的优化  48
    4.2.3 诱变对转化的影响  48
    4.2.4 底物浓度对转化的影响  48
    4.2.5 底物加入时间对转化的影响  48-49
    4.2.6 溶氧量对转化的影响  49
    4.2.7 助溶剂对转化的影响  49
  4.3 结果与讨论  49-54
    4.3.1 转化产物 HPLC 检测及结构鉴定  49-51
    4.3.2 菌株 WM-1 种龄的测定  51
    4.3.3 培养基条件优化  51-53
    4.3.4 底物浓度对转化的影响  53
    4.3.5 底物加入时间对转化的影响  53-54
    4.3.6 溶氧量对转化的影响  54
    4.3.7 助溶剂对转化的影响  54
  4.4 总结  54-56
结论  56-57
参考文献  57-60
致谢  60

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