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产脂肪酶菌株的筛选、鉴定及产酶条件优化

作　者: 麻琼丽
导　师: 张家明
学　校: 海南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 脂肪酶筛选菌株鉴定产酶优化洋葱伯克霍尔德菌铜绿假单胞菌酶学性质
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

从海口市各地采集含油污土样10份,富集培养得到产脂肪酶细菌优势菌种,梯度稀释后,以花生油为唯一碳源采用油脂固体平板透明圈法进行分离纯化,得到145株产脂肪酶的菌株。再经摇瓶复筛,获得两株产脂肪酶活力较高的菌株,编号分别为C737-11和C7828-5。按照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》(2004版)的方法对两株菌进行了生理生化鉴定,以及结合分子生物学鉴定,确定菌株C737-11为洋葱伯克霍尔德氏Ⅰ型菌,菌株C7828-5为铜绿假单胞菌。菌株C737-11粗酶的最适作用温度为37℃,最适pH值为8.0,初步优化了C737-11的产脂肪酶条件,获得高达10.5 U mL-1的脂肪酶活性。应用单因子试验和正交实验对铜绿假单胞菌C7828-5产脂肪酶发酵培养基进行了快速优化。首先应用单因子试验确定铜绿假单胞菌C7828-5产脂肪酶最适碳源和最适氮源分别是花生油和蔗糖组合及牛肉膏。在此基础上通过L9(34)正交试验,考察了花生油、蔗糖、牛肉膏、硫酸铵等四个因素对产酶的影响,获得优化的培养基组成。最后通过单因子试验确定最适发酵温度、最适起始pH、最适接种量及最适摇床转速等。试验获得的优化培养条件为：蔗糖5gL-1、牛肉膏20 g L-1、(NH4)2SO4 1 g L-1、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、CaCl20.5gL-1,聚乙烯醇花生油乳化液120 mLL1,起始pH7.0,培养温度28℃,转速为200 r min-1,培养72h后,获得高达8.08 U mL-1的脂肪酶表达量。对菌株的发酵粗酶液进行了酶学性质探讨,结果表明菌株C737-11和C7828-5脂肪酶的最适作用温度和最适作用pH分别都是37℃和8.0,都属于中温弱碱性酶。菌株C737-11脂肪酶热稳定性良好,50℃处理60 min后还有82%的酶活力；60℃处理40 min后还有55%的酶活力；70℃处理20 min后还有63%的酶活力；该脂肪酶在pH6.0-8.0范围内具有较好的稳定性,不过,在强碱性条件下(pH9-10),该酶稳定性较差。菌株C7828-5脂肪酶60℃处理1 h后酶活力几乎丧失,在pH 5.0-10.0范围内具有较好的稳定性,而且在中性条件下(pH 7.0),该酶酶活性仍保持不变,pHH10.0温浴1 h后仍有45%的酶活性。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
1 前言  10-28
  1.1 脂肪酶的简介  10-13
    1.1.1 脂肪酶的分子结构及特征  11-12
    1.1.2 脂肪酶的作用机理  12-13
  1.2 产脂肪酶的微生物  13-14
  1.3 产脂肪酶菌的筛选方法  14-15
  1.4 脂肪酶活性测定方法  15-17
    1.4.1 碱滴定法  16
    1.4.2 PNPB法  16
    1.4.3 皂铜法  16-17
  1.5 脂肪酶活性的影响因素  17
  1.6 生物柴油概述  17-27
    1.6.1 生物柴油研究现状  17-18
    1.6.2 生物柴油的制备方法  18-25
      1.6.2.1 直接混合法  18-19
      1.6.2.2 热解法  19
      1.6.2.3 微乳化法  19
      1.6.2.4 酯交换法  19-25
    1.6.3 生物柴油的发展趋势  25-27
      1.6.3.1 国外生物柴油的进展  25-26
      1.6.3.2 国内生物柴油的进展  26-27
  1.7 本课题的研究目的与意义  27
  1.8 创新  27-28
  1.9 本研究的技术路线  28
2 实验材料、试剂及仪器  28-31
  2.1 材料  28
  2.2 试剂  28-29
    2.2.1 购买试剂  28
    2.2.2 配制试剂  28-29
  2.3 主要仪器设备  29
  2.4 培养基  29-31
3 实验方法  31-39
  3.1 产脂肪酶菌株的筛选  31-32
    3.1.1 富集培养  31
    3.1.2 平板分离  31
    3.1.3 产脂肪酶菌株的复筛  31
    3.1.4 脂肪酶产生菌的保藏方法  31
    3.1.5 脂肪酶活性的测定  31-32
  3.2 菌株分类鉴定  32-33
    3.2.1 革兰氏染色  32
    3.2.2 固体平板上的菌落形态观察  32
    3.2.3 运动性试验  32-33
    3.2.4 不同温度对生长影响的测定  33
  3.3 细菌的生理生化特征试验  33-34
  3.4 16S rRNA序列分析  34-36
    3.4.1 细菌基因组DNA的提取  34
    3.4.2 16S rRNA基因的扩增及分析  34-36
  3.5 Fur基因序列分析  36-39
    3.5.1 B.cepacia全基因组DNA提取  36
    3.5.2 Fur基因扩增及分析  36-37
    3.5.3 PCR产物的克隆  37-39
4 结果与分析  39-57
  4.1 菌株筛选  39-40
  4.2 菌株的鉴定  40-45
    4.2.1 菌株C737-11的鉴定  40-44
      4.2.1.1 形态学、生理生化特征  40
      4.2.1.2 分子生物学鉴定  40-44
    4.2.2 菌株C7828-5的鉴定  44-45
      4.2.2.1 形态学、生理生化特征  44
      4.2.2.2 分子生物学鉴定  44-45
  4.3 产酶条件优化  45-54
    4.3.1 C737-11菌株的产酶条件优化 #36.  45-47
      4.3.1.1 碳、氮源优化  45-46
      4.3.1.2 不同起始pH对产酶的影响  46-47
    4.3.2 C7828-5菌株的产酶条件优化  47-54
      4.3.2.1 菌株生长产酶培养基优化  47-51
      4.3.2.2 金属离子对产酶的影响  51
      4.3.2.3 菌株产酶条件优化  51-54
  4.4 酶学性质研究  54-57
    4.4.1 C737-11脂肪酶的酶学特性  54-56
      4.4.1.1 酶反应最适温度  54
      4.4.1.2 酶反应的最适pH  54-55
      4.4.1.3 酶的热稳定性  55
      4.4.1.4 酶的pH稳定性  55-56
    4.4.2 C7828-5脂肪酶的酶学特性  56-57
      4.4.2.1 酶反应的最适温度  56
      4.4.2.2 酶反应的最适pH  56
      4.4.2.3 酶的热稳定性  56
      4.4.2.4 酶的pH稳定性  56-57
5 讨论  57-61
  5.1 脂肪酶产生菌的筛选  57-59
  5.2 菌株的鉴定  59-60
  5.3 脂肪酶活力测定方法的选择  60
  5.4 菌株的产酶条件优化  60-61
  5.5 脂肪酶的酶学性质  61
6 结论  61-63
7 存在的问题与讨论  63-64
参考文献  64-74
致谢  74

产脂肪酶菌株的筛选、鉴定及产酶条件优化

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