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赤拟谷盗剂量补偿相关基因的鉴定及RNAi分析

作　者: 王艳允
导　师: 李斌
学　校: 南京师范大学
专　业: 动物学
关键词: 赤拟谷盗剂量补偿 RNAi Males absent on the first 生殖
分类号: Q963
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

剂量补偿机制(Dosage compensation mechanism)是雄性与雌性的X染色体表达量平衡的关键机制,保证两性中从X染色体上编码的蛋白质或其他酶类物质在数量上达到平衡。不同物种的剂量补偿机制各不一样,迄今的研究表明,剂量补偿机制主要有以下3种模式：通过雌性的一条X染色体失活；通过雄性的单个X染色体表达加倍；通过雌性的两个X染色体的表达减半来达到平衡。赤拟谷盗(Tribolium castaneum)是一种危害严重的储粮害虫,也是鞘翅目昆虫的代表,一种新型的模式昆虫。而且赤拟谷盗是唯一与线虫一样具有高效的系统性RNA干扰(RNA interference,RNAi)机制的昆虫,从而使赤拟谷盗成为基因功能研究的优良模式生物。迄今为止,赤拟谷盗的剂量补偿机制尚不清楚,最近用Microrray的方法表明赤拟谷盗的X雄/A雄为1.0、X雄/X雌为0.79、X雄/A雌为1.53(X：X染色体,A：常染色体),而有剂量补偿生物中这三者均约为1,因此作者推测赤拟谷盗是一种不完美的剂量补偿机制,为进一步探讨赤拟谷盗的剂量补偿效应,我们以果蝇的剂量补偿关键基因为参考在赤拟谷盗中鉴定了其同源基因,并利用RNAi的方法探讨了他们的功能。我们从赤拟谷盗中鉴定并克隆了msl2、msl3a&b(在6号和10号染色体各有一个拷贝,分别是msl3a和msl3b)、mof和mle5个基因,分别命名为Tcmsl2、Tcmsl3a&b、 Tcmof和Tcmle。系统发育分析表明,MOF在真核生物中是高度保守的,有三个保守的结构域,但是在鸟类中却丢失了,而且在昆虫中发生了分化。实时定量PCR结果显示,Tcmsl2在蛹到成虫期中,雌性表达均高于雄性,Tcmsl3a&b在早期蛹和晚期成虫中表达量较高,而Tcmsl3a&b在早期雌性成虫中表达高于雄性；基因Tcmof和Tcmle的表达有时期特异性,但是在雌雄之间表达没有差异。RNAi分析结果表明,基因Tcmof被敲减后,赤拟谷盗发育受到明显影响,79.1%不能正常的从蛹到羽化成虫,最终导致100%的虫子死亡；Tcmle基因在晚期幼虫被敲减后,除在晚期成虫的死亡率比对照组稍大外,在其他的时期对赤拟谷盗的生长发育都几乎没有影响；而其它两个基因Tcmsl2和Tcmle对赤拟谷盗的生长发育影响不大。基因Tcmof被抑制表达之后还严重的影响了赤拟谷盗的生殖,导致不能产卵,而且这种效应主要是母本效应所介导,而其它四个基因对赤拟谷盗的生殖和卵的孵化几乎没有影响。这些显示赤拟谷盗的剂量补偿机制与黑腹果蝇的剂量补偿机制不同,即使在赤拟谷盗中有剂量补偿,但msl2、msl3a、msl3b、mof和m/e这5个基因可能没有参与到剂量补偿。Tcmof对赤拟谷盗的生长、发育和生殖都是必须的,很有可能是参与到NSL(Non-specific lethal)复合物中,该复合物能广泛调节雌性和雄性的性染色体和常染色体基因的表达。本研究有助于揭示X连锁基因的调控机理、性染色体的进化和分化过程,以及解释性染色体畸变的机理,也为以后研究其他物种的剂量补偿及其他表观遗传学奠定基础。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-7
主要英文缩写简表  7-10
第1章绪论  10-21
  1.1 剂量补偿研究现状  10-11
  1.2 雄性的X染色体表达上调机制  11-15
    1.2.1 黑腹果蝇剂量补偿机制中的上游调控信号  11
    1.2.2 黑腹果蝇剂量补偿复合物的成员  11-12
    1.2.3 剂量补偿复合物亚基的结构和功能  12-13
    1.2.4 剂量补偿复合物靶向X染色体  13-14
    1.2.5 剂量补偿复合物的量对剂量补偿机制的影响  14-15
    1.2.6 剂量补偿复合物亚基的其他功能  15
  1.3 雌性一条X染色体失活机制  15-16
  1.4 雌性的两条X染色体下调机制  16-18
  1.5 赤拟谷盗的剂量补偿研究现状  18
  1.6 本文研究的目的和意义  18-21
第2章赤拟谷盗剂量补偿相关基因的鉴定和生物信息学分析  21-36
  2.1 材料与方法  21-26
    2.1.1 实验材料  21
    2.1.2 实验主要试剂和仪器  21
    2.1.3 方法与步骤  21-26
  2.2 实验结果与分析  26-34
    2.2.1 黑腹果蝇和线虫的剂量补偿基因在赤拟谷盗中的鉴定  26-27
    2.2.2 赤拟谷盗Tcmsl2、Tcmsl3a、Tcmsl3b、Tcmof和Tcmle基因的内含子和外显子结构  27-29
    2.2.3 赤拟谷盗MOF结构域和序列分析  29-33
    2.2.4 赤拟谷盗Tcmof基因进化分析  33-34
  2.3 讨论  34-36
第3章赤拟谷盗基因msl2、msl3a&b、mof、mle的RNAi分析  36-56
  3.1 实验材料、仪器及试剂  36-37
    3.1.1 实验材料与仪器  36
    3.1.2 实验主要试剂  36-37
  3.2 实验方法  37-41
    3.2.1 赤拟谷盗5个相关基因的表达模式分析  37-38
    3.2.2 赤拟谷盗5个相关基因的RNAi分析  38-40
    3.2.3 数据处理  40-41
  3.3 实验结果  41-54
    3.3.1 5个基因半定量表达模式分析  41-42
    3.3.2 注射dsRNA后基因的表达量  42-43
    3.3.3 5个基因RNAi后对赤拟谷盗表型的影响  43-44
    3.3.4 赤拟谷盗5个基因RNAi后对死亡率的影响  44-49
    3.3.5 赤拟谷盗5个基因RNAi后对生殖的影响  49-52
    3.3.6 5个基因RNAi后产生卵的孵化率  52-53
    3.3.7 赤拟谷盗Tcmof基因RNAi的定量分析  53-54
  3.4 讨论  54-56
第4章结论  56-58
参考文献  58-65
在读期间已/待发表的学术论文  65-66
致谢  66

赤拟谷盗剂量补偿相关基因的鉴定及RNAi分析

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