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miR192、miR166及其靶基因HD-Zip对水稻镉胁迫应答的功能研究

作　者: 刘海丽
导　师: 朱诚
学　校: 中国计量学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 水稻 miR192 miR166 靶基因 镉 转基因
分类号: Q945.78
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


microRNA （miRNA）是一类长度约为21－27核苷酸的小分子非编码RNA，广泛存在于真核生物中。它在转录后水平负调控靶基因的表达，因而在植物生长发育、激素分泌与信号转导和逆境应答等过程中发挥重要作用。miRNA的靶基因通常是调控植物生长发育和信号转导通路中的转录因子，表明它处于基因表达调控网络的核心位置。本研究以粳稻中花11为材料，以前期利用miRNA芯片分离得到的miR166和miR192作为研究对象，通过构建miR166和miR192前体序列的过表达载体获得转基因水稻株系，对转基因水稻的镉胁迫研究证实过表达miR192株系增强了种子萌发时对镉的敏感性，过表达miR166株系增强了种子萌发和幼苗对镉的耐性。利用生物信息学对它们的靶基因的预测分析获得ATP结合蛋白（ATP binding protien，ABC）为miR192的靶基因和同源异型域亮氨酸拉链蛋白（Homeodomain leucine zipper protein，HD-Zip）为miR166的靶基因。利用荧光定量PCR技术对镉胁迫下野生型中花11和转基因水稻中miR166和HD-Zip的表达量进行检测分析，验证了miR166对HD-Zip的负调控。在以上工作的基础上构建了HD-Zip的过表达载体和RNAi表达载体，并利用农杆菌介导的遗传转化获得转基因水稻植株，为进一步探明miRNA及其靶基因调控水稻抗镉的分子机制奠定了基础。

全文目录


致谢  5-6
摘要  6-7
Abstract  7-11
图清单  11-12
表清单  12-13
1. 文献综述  13-25
  1.1. 植物的镉耐性机理  13-14
    1.1.1. 阻止镉的吸收  13
    1.1.2. 螯合作用和液泡区室化  13-14
    1.1.3. 激活抗氧化防御系统和诱导胁迫蛋白  14
  1.2. 植物 miRNA  14-22
    1.2.1. 植物 miRNA 的生物合成  14-15
    1.2.2. 植物 miRNA 的功能  15-21
    1.2.3. 植物 miRNA 之间的相互作用  21
    1.2.4. 植物 miRNA 的运输  21-22
  1.3. HD-Zip 转录因子  22-23
    1.3.1. HD-Zip 转录因子的结构特征  22
    1.3.2. HD-Zip 转录因子的分类  22-23
    1.3.3. HD-Zip 转录因子的生理功能  23
  1.4. 研究目的及意义  23-25
2. miRNA 过表达载体的构建  25-34
  2.1. 材料和方法  25-31
    2.1.1. 试验材料  25-26
    2.1.2. 试验方法  26-31
  2.2. 结果与分析  31-32
    2.2.1. 过表达载体 35S:MIRNA 的构建  31-32
    2.2.2. 含有 35S:MIRNA 过表达重组质粒农杆菌阳性克隆的鉴定  32
  2.3. 讨论  32-34
3. 农杆菌介导的水稻遗传转化  34-40
  3.1. 材料和方法  34-38
    3.1.1. 试验材料  34
    3.1.2. 试验试剂和引物  34
    3.1.3. 培养基  34-36
    3.1.4. 农杆菌介导的水稻遗传转化方法  36-37
    3.1.5. T_0代转基因植株的鉴定  37
    3.1.6. T_1代转基因植株的鉴定  37-38
  3.2. 结果与分析  38-40
    3.2.1. 转基因植株的获得  38
    3.2.2. 转基因植株的鉴定  38-40
4. 过表达 miR166 和 miR192 水稻镉胁迫耐受性研究  40-43
  4.1. 材料和方法  40
    4.1.1. 试验材料  40
    4.1.2. 镉处理对转基因水稻种子萌发的影响  40
    4.1.3. 镉处理对转基因水稻苗期表型的影响  40
  4.2. 结果与分析  40-42
    4.2.1. 过表达 miR166 株系对镉处理下种子萌发和幼苗生长的影响  40-41
    4.2.2. 过表达 miR192 株系对镉处理下种子萌发的影响  41-42
  4.3. 讨论  42-43
5. miRNA 靶基因的预测和表达分析  43-48
  5.1. 材料和方法  43-45
    5.1.1. 试验材料  43
    5.1.2. 试验试剂  43
    5.1.3. miRNA 靶基因生物信息学预测  43
    5.1.4. 镉胁迫下 miRNA 及其靶基因的表达量检测  43-45
  5.2. 结果与分析  45-46
    5.2.1. miRNA 靶基因生物信息学预测  45
    5.2.2. 镉处理下 miRNA 及其靶基因表达水平的检测  45-46
    5.2.3. 35S:MIRNA 转基因水稻中 miR166 和 OsHD-Zip 表达量检测  46
  5.3. 讨论  46-48
6. 水稻 OsHD-zip 基因过表达载体的构建及遗传转化  48-52
  6.1. 材料和方法  48-50
    6.1.1. 试验材料  48
    6.1.2. 试验试剂  48
    6.1.3. 水稻 OsHD-zip 基因过表达载体的构建  48-49
    6.1.4. 农杆菌介导的水稻转基因  49-50
  6.2. 结果与分析  50-51
    6.2.1. 过表达载体 p1300GFP- OsHD-zip 的构建  50
    6.2.2. 转基因植株的获得  50-51
    6.2.3. 转基因植株的鉴定  51
  6.3. 讨论  51-52
7. 水稻 OsHD-Zip 基因 RNAi 表达载体的构建及遗传转化  52-56
  7.1. 材料和方法  52-54
    7.1.1. 试验材料  52
    7.1.2. 试验试剂  52
    7.1.3. 克隆引物设计  52-53
    7.1.4. RNAi 表达载体构建流程  53-54
    7.1.5. 农杆菌介导的水稻转基因  54
  7.2. 结果与分析  54-55
    7.2.1. RNAi 表达载体 p1300-OsHDRNAi 的构建  54-55
    7.2.2. 转基因植株的获得  55
  7.3. 讨论  55-56
8. 全文总结和展望  56-57
参考文献  57-63
作者简历  63

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物生理学 > 协迫生理学
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