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谷氨酸棒杆菌中共表达短乳杆菌来源的谷氨酸脱羧酶生产γ-氨基丁酸

作　者: 江君君
导　师: 史锋
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: 谷氨酸棒杆菌 短乳杆菌 谷氨酸脱羧酶酸 γ-氨基丁酸 发酵优化
分类号: TQ920.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid，简称GABA）是由谷氨酸脱羧酶（Glutamatedecarboxylase，简称GAD）催化L-谷氨酸发生不可逆的α-脱羧反应生成的，具有多种生理功能，被广泛应用于食品、医药和农业等行业。实验室前期研究了一种简单经济的GABA生产方式，即在谷氨酸棒杆菌中表达短乳杆菌Lb85来源的一个谷氨酸脱羧酶基因，能直接将自身合成的L-谷氨酸转变成GABA，但是产量比较低。因此，本研究是在前期工作的基础上构建了一株谷氨酸棒杆菌工程菌，将短乳杆菌Lb85来源的两个谷氨酸脱羧酶基因gadB1、gadB2进行共表达，通过发酵优化显著提高了GABA的产量。主要研究内容和结果如下：(1)首先分别构建了gadB1和gadB2单基因表达菌ATCC13032/pDXW-10-gadB1、ATCC13032/pDXW-10-gadB2和二者共表达的工程菌ATCC13032/pDXW-10-gadB1-gadB2；然后将三株工程菌进行初步发酵比较GABA合成能力，发现ATCC13032/pDXW-10-gadB1-gadB2GABA合成能力（4.02g/L）明显高于另外两株，因此确定以ATCC13032/pDXW-10-gadB1-gadB2为主进行发酵优化。(2)正交试验优化种子培养基，得到最佳种子培养基配方（g/L）：葡萄糖25，玉米浆30，尿素8，K2HPO43H2O1，MgSO40.2，培养8h转接发酵。单因素实验优化发酵培养基，确定葡萄糖和玉米浆浓度分别为100g/L和4g/L，在发酵前期10h-24h每隔3.5h补加2.4g/L尿素，并于10h补加0.1mM5’-磷酸吡哆醛（简称PLP），最终GABA的产量达到19.64±3.77g/L，此时L-谷氨酸的转化率为0.69mol/mol。(3)在发酵优化后，研究了ATCC13032/pDXW-10-gadB1-gadB2发酵过程各个参数的变化，结果显示：整个发酵过程GAD一直具有活性，使得胞内GABA持续积累，而且GABA的分泌和L-谷氨酸的消耗引起胞外pH的变化，在此基础上进行了一个延时至120h的发酵，最终GABA产量达到27.13±0.54g/L，L-谷氨酸的转化率达到0.74mol/mol。(4)最后，将ATCC13032/pDXW-10-gadB1-gadB2在3L罐上进行发酵，发酵72h后GABA产量达到26g/L，L-谷氨酸的转化率达0.6mol/mol，相对于摇瓶发酵GABA生产强度有所提高。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-5
目录  5-7
第一章 绪论  7-15
  1.1 γ-氨基丁酸  7-10
    1.1.1 GABA 结构与理化性质  7
    1.1.2 GABA 的生理功能和应用  7-8
    1.1.3 GABA 的生产方法  8-9
    1.1.4 GABA 的代谢途经  9-10
  1.2 谷氨酸脱羧酶  10-11
  1.3 谷氨酸棒杆菌和 L-谷氨酸的合成  11-13
    1.3.1 谷氨酸棒杆菌  11
    1.3.2 L-谷氨酸及其生物合成途经  11-12
    1.3.3 影响 L-谷氨酸生物合成的要素  12-13
  1.4 立题背景与意义  13-14
  1.5 研究思路和研究内容  14-15
第二章 实验材料与方法  15-23
  2.1 实验材料  15-17
    2.1.1 菌株、质粒及引物  15
    2.1.2 培养基  15-16
    2.1.3 工具酶、试剂和试剂盒  16-17
    2.1.4 实验仪器  17
  2.2 实验方法  17-23
    2.2.1 基因组的提取和目的基因的扩增  17-18
    2.2.2 大肠杆菌感受态的制备和转化  18
    2.2.3 谷氨酸脱羧酶基因共表达重组质粒的构建  18-20
    2.2.4 谷氨酸棒杆菌工程菌的构建  20
    2.2.5 谷氨酸棒杆菌工程菌摇瓶发酵及其优化  20-21
    2.2.6 谷氨酸棒杆菌工程菌 GAD 酶活和胞内氨基酸含量测定  21-22
    2.2.7 谷氨酸棒杆菌工程菌上罐发酵生产 GABA  22
    2.2.8 分析方法  22-23
第三章 结果与讨论  23-41
  3.1 重组质粒与谷氨酸棒杆菌工程菌的构建  23-24
    3.1.1 重组质粒的构建  23-24
    3.1.2 谷氨酸棒杆菌工程菌的构建  24
    3.1.3 阶段小结  24
  3.2 谷氨酸棒杆菌工程菌 GABA 合成能力比较  24-25
    3.2.1 谷氨酸棒杆菌工程菌初步发酵比较  24-25
    3.2.2 阶段小结  25
  3.3 工程菌 ATCC 13032/pDXW-10-gadB1-gadB2 摇瓶发酵初步优化  25-31
    3.3.1 种子培养基优化和生长曲线测定  26-27
    3.3.2 尿素补加次数对 GABA 合成的影响  27-29
    3.3.3 葡萄糖浓度对 GABA 合成的影响  29
    3.3.4 玉米浆浓度对 GABA 合成的影响  29-30
    3.3.5 PLP 的添加对 GABA 合成的影响  30-31
    3.3.6 阶段小结  31
  3.4 工程菌 ATCC 13032/pDXW-10-gadB1-gadB2 发酵过程各参数研究  31-38
    3.4.1 发酵过程 OD562和残糖变化  32-33
    3.4.2 胞外 pH 变化和氨基酸产量变化的关系  33-35
    3.4.3 胞内 L-谷氨酸和 GABA 积累水平以及比酶活变化  35-37
    3.4.4 延时发酵提高 GABA 产量  37-38
    3.4.5 阶段小结  38
  3.5 工程菌 ATCC 13032/pDXW-10-gadB1-gadB2 上罐发酵  38-41
    3.5.1 发酵过程 OD562和残糖变化  38-40
    3.5.2 发酵过程胞外 pH 和氨基酸含量变化  40
    3.5.3 阶段小结  40-41
主要结论与展望  41-43
致谢  43-44
参考文献  44-49
附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文  49

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 一般性问题 > 基础理论
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