学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

靶向脑心肌炎病毒1D和3AB基因shRNA重组体构建与体内外抑制病毒复制作用

作　者: 白娟
导　师: 姜平
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: EMCV 病毒分离 基因分析 shRNA 重组腺病毒
分类号: S852.65
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
下　载: 19次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus, EMCV)是一种重要的人畜共患病病原,可以感染昆虫、爬行动物、啮齿类动物和灵长类动物等。本病毒可引起仔猪的致命性心肌炎和母猪的繁殖障碍,对世界养猪业造成了较大经济损失。目前,我国猪群已经存在该病毒感染,但其流行状况尚不十分清楚,也无有效预防和治疗方法。本研究从我国中东地区患病猪群分离获得EMCV NJ08毒株,人工感染试验证实我国存在该病,并完成该病毒全基因序列分析,阐明我国EMCV流行毒株分子特征；同时,设计构建了表达靶向EMCV不同基因shRNA表达质粒,发现其在体外和体内可以有效抑制EMCV复制及其机制,并利用腺病毒介导shRNA技术探讨该病防治新策略,为该病防治提供了新手段。1.猪源脑心肌炎病毒的分离与鉴定本研究采集临床发病仔猪心脏组织,匀浆处理后接种BHK-21细胞,盲传3代出现细胞病变,分离获得一株病毒,病毒传代至第15-25代,病毒滴度稳定,TCID50为10-100～10-10-25/mL;采用脑心肌炎病毒(EMCV)单克隆抗体进行间接免疫荧光试验,结果在感染细胞的胞浆中可见特异性荧光；EMCV VP1基因RT-PCR检测为阳性,扩增产物基因序列与GenBank中的EMCV VP1基因同源性为85.7%-99.8%；纯化病毒粒子负染电镜观察,大小约25-28nm,证明该分离病毒为EMCV,命名为EMCV NJ08株。该分离株接种MARC-145、HEK-293A和ST细胞系均出现明显CPE,病毒于56℃作用15min,感染滴度显著降低。将NJ08株接种BALB/c小鼠,可引起小鼠出现明显临床症状和心肌变性与脑炎等病变,免疫组织化学试验检测结果证明,脑组织含有EMCV抗原；商品仔猪人工感染NJ08株后未出现明显的临床症状及病理变化,但血清中出现EMCV特异性中和抗体,证明该分离株对小鼠具有较强的致病作用,表明我国猪群存在EMCV感染。2.猪脑心肌炎病毒NJ08分离株基因组序列测定与分析本研究根据EMCV基因序列,设计合成7对PCR引物,采用RT-PCR方法从EMCV NJ08分离株扩增获得5个基因片段,大小为1002-1580bp,同时,应用RACE方法,从该病毒株扩增获得其3’和5’基因末端两个基因,扩增产物经凝胶纯化后分别克隆于pMD18-T载体,进行基因测序,利用片段之间的重叠碱基序列顺序将这些片段序列进行拼接,获得EMCV NJ08株全基因组cDNA序列,并将全基因组及其推导的氨基酸序列与GenBank中登录的国内外参考病毒株进行同源性比较及系统进化分析。结果为：EMCV NJ08分离株基因组全长7724bp；属于Ⅰa亚群；与GXLC、 GX0602、BJC3、HB1等国内分离株以及BEL-2887A、CBNU、K3、K11、EMCV-R、PV21等国外分离株同源性达99%以上；EMCV流行株的非结构蛋白中3D最为保守,2A变异最大,结构蛋白中VP2最为保守,VP1变异最大,从而丰富了我国EMCV分子流行病学资料。3.脑心肌炎病毒SYBR Green Ⅰ实时PCR检测方法的建立本研究分别针对EMCV NJ08株的1D和3AB基因设计合成了特异性的引物,通过反应条件的优化,利用SYBR Green Ⅰ染料建立了快速定量检测脑心肌炎病毒的实时PCR方法。通过检测PCV2、PRRSV、CSFV、PRV和FMDV的基因检测及融解曲线检测分析,结果表明两对引物实时PCR反应的熔解曲线具有唯一的尖峰,证明其具有较好的特异性。采用EMCV cDNA产物进行梯度稀释后作为模板进行检测,结果为：该方法对EMCV细胞培养物的检测下限为0.01TCID50,敏感性比普通RT-PCR高100倍,并具有较好重复性。分别采用该法和普通RT-PCR方法检测10份EMCV人工感染的小鼠心肌、脑组织、5份EMCV人工感染仔猪血清样品及3份健康小鼠心脑组织和2份健康仔猪血清样品检测,其符合率为100%。表明该方法具有较高特异性和敏感性,同时具有更快速、准确、低污染等优点,可用于定量检测EMCV和该病诊断。4.靶向EMCV1D和3AB基因shRNA重组质粒构建及其体内外抑制EMCV复制作用本研究根据EMCV NJ08株基因序列(GenBank HM641897),采用计算机软件设计针对1D和3AB基因的4个siRNA靶序列,按pSUPER载体要求,合成了4对互补的寡核苷酸,分别体外退火形成双链,克隆至pSUPER载体,经Kpn Ⅰ/EcoR Ⅰ双酶切鉴定和基因测序,证明构建获得4个shRNA (short hairpin RNA)重组质粒(pSUPER-1D-1, pSUPER-1D-2, pSUPER-3AB-1和pSUPER-3AB-2).将其分别转染BHK-21细胞,观察其抑制EMCV NJ08复制及其机制,并以pSUPER-mN3(shRNA序列长度相同)为对照质粒,结果为：pSUPER-1D-1, pSUPER-3AB-1和pSUPER-3AB-2均能明显减轻EMCV引起的细胞病变(CPE). pSUPER-3AB-1和pSUPER-3AB-2转染细胞中EMCV>商度降低100-1000倍,pSUPER-1D-2或pSUPER-1D-1组病毒滴度降低10-100倍,EMCV VP1蛋白和3AB mRNA转录水平均明显降低(p<0.05)。选取90只4周龄BALB/c小鼠,随机分为6组,每组15只。第1-4组分别脑内接种重组质粒pSUPER-1D-1、pSUPER-3AB-1、pSUPER-3AB-2和pSUPER-mN3,第5组脑内接种ddH2O作为阴性对照,第6组为空白对照组。第1-5组接种后6h、12h和24h,分别每组随机选择5只小鼠,采用EMCV进行攻击,观察临床症状和死亡鼠病变,并于攻毒后14d,对存活小鼠全部剖杀,进行病理学观察,并用实时PCR方法检测小鼠脑组织中EMCV含量。结果为：与pSUPER-mN3组和攻毒对照组相比,pSUPER-VP1-1、pSUPER-3AB-1和pSUPER-3AB-2组小鼠临床症状、脑和心脏组织病变程度明显减轻,病死率明显降低,表明靶向EMCV1D和3AB基因的shRNA可以有效减低EMCV靶基因转录、表达和病毒复制,降低EMCV对小鼠致病作用。5.靶向EMCV1D和3AB基因shRNA的重组腺病毒的构建与鉴定本研究以shRNA重组质粒pSUPER-1D-1、pSUPER-1D-2、pSUPER-3AB-1和pSUPER-3AB-2为模板,利用RT-PCR扩增获得4个PH1-shRNA表达框,分别克隆至重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,然后与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183内进行同源重组,再将重组质粒经转染HEK-293A细胞,获得表达针对EMCV1D或3AB基因的shRNA重组腺病毒,命名为rAd-1D-1、rAd-1D-2、rAd-3AB-1和rAd-3AB-2,重组腺病毒接种HEK-293A细胞后,出现明显CPE,呈变圆和脱落,同时在荧光显微镜下出现特异性荧光。提取HEK-293A细胞中的病毒DNA,利用PCR和基因序列分析,证明重组腺病毒基因组内PH1-shRNA表达框内基因序列正确,证明构建获得靶向EMCV1D或3AB shRNA的重组腺病毒,为EMCV感染防治研究奠定了基础。6.腺病毒介导的靶向EMCV1D和3AB基因shRNA体内外抑制EMCV复制作用本研究将4个靶向EMCV1D (rAd-1D-1和rAd-1D-2)和3AB (rAd-3AB-1和rAd-3AB-2) shRNA重组腺病毒(rAd5)分别接种MARC-145细胞,并以rAd-G1重组腺病毒为对照,观察其对EMCV复制作用,结果为：与对照组相比,该4个rAd5可以明显抑制EMCV靶基因mRNA转录和蛋白表达水平及病毒复制滴度,而且这种抗病毒抑制作用至少能持续72h,并有剂量依赖性。rAd5接种已经感染EMCV的MARC-145细胞,可以部分抑制EMCV复制。选取96只6周龄BALB/c小鼠,随机分为6组,每组16只。第1-4组腹腔接种rAd-1D-2、rAd-3AB-1、rAd-3AB-2和rAd-G1(阴性对照),其中8只小鼠接种剂量为107.0efu/mouse,另8只小鼠接种剂量为108.0efu/mouse,12h后在每只小鼠腹腔注射200TCID50的EMCV NJ08株病毒液,第5组作为EMCV攻毒对照组,第6组只注射PBS作为正常对照组。攻毒后观察临床症状和病理变化,第21d,对存活的小鼠全部剖杀,观察病变,并用实时PCR方法检测小鼠脑组织中EMCV含量。结果为：第1-5组小鼠均表现出不同程度临床症状和肉眼病变,与rAdG1阴性对照组和攻毒对照组相比,rAd-1D-2、rAd-3AB-1和rAd-3AB-2接种组临床症状明显减轻,且出现时间大大推迟,其中,rAd-1D-2(1080efu/mouse)接种组小鼠存活率为87.5%,而对照组小鼠全部死亡；脑组织中病毒病毒含量明显降低。该结果表明,由重组腺病毒介导的shRNA能在体内外有效抑制EMCV的复制,并有效提供小鼠对EMCV攻击,从而为该病防控提供了新策略。

全文目录


摘要  10-14
ABSTRACT  14-19
第一章 脑心肌炎研究进展  19-39
  1 EMCV的生物学特性  19-21
  2 流行病学  21-22
  3 致病机理  22-23
    3.1 EMCV致病分子基础  22
    3.2 机体损伤及免疫应答  22-23
  4 EMCV诊断技术  23-26
    4.1 抗原检测  24-25
    4.2 病毒抗体检测  25-26
  5 疫苗  26-28
    5.1 常规疫苗  26-27
    5.2 基因工程疫苗  27-28
  6 防控  28-29
  参考文献  29-39
第二章 RNA干扰技术研究进展  39-61
  1 RNAi的发生机制  39-41
  2 RNAi技术主要特征  41-42
  3 RNA干扰实验技术  42-43
    3.1 RNAi分子设计  42-43
    3.2 siRNA实施手段  43
  4 介导RNAi的病毒载体  43-46
    4.1 逆转录病毒载体  44
    4.2 腺病毒载体  44-45
    4.3 慢病毒载体  45
    4.4 腺相关病毒载体  45-46
    4.5 杆状病毒载体  46
  5 RNAi抗病毒应用  46-50
  6 RNAi技术前景  50-52
  参考文献  52-61
第三章 猪源脑心肌炎病毒的分离与鉴定  61-81
  摘要  61-62
  1 材料与方法  62-68
    1.1 病料来源  62
    1.2 细胞与抗体  62
    1.3 其它主要试剂  62
    1.4 病毒分离  62
    1.5 TCID_(50)测定  62
    1.6 间接免疫荧光试验(IFA)  62-63
    1.7 EMCV VP1基因RT-PCR与序列分析  63-65
    1.8 病毒浓缩纯化与电镜观察  65-66
    1.9 病毒对不同细胞系易感性  66
    1.10 病毒耐热性试验  66
    1.11 小鼠攻毒试验  66
    1.12 仔猪攻毒试验  66-67
    1.13 组织病理学观察  67
    1.14 免疫组织化学试验  67-68
    1.15 血清中和抗体检测  68
  2 结果  68-75
    2.1 病毒分离培养  68-69
    2.2 间接免疫荧光试验  69-70
    2.3 EMCV VP1基因RT-PCR扩增和序列分析  70-71
    2.4 电镜观察  71
    2.5 病毒对其它细胞系的易感性  71-72
    2.6 病毒耐热性  72
    2.7 小鼠人工感染试验  72-74
    2.8 仔猪人工感染试验  74-75
  3 讨论  75-77
  参考文献  77-79
  ABSTRACT  79-81
第四章 猪脑心肌炎病毒NJ08分离株全基因组序列测定与分析  81-99
  摘要  81-82
  1 材料与方法  82-91
    1.1 细胞和病毒  82
    1.2 主要试剂  82
    1.3 引物设计  82-84
    1.4 RNA的提取  84
    1.5 片段F1-F5的RT-PCR扩增  84
    1.6 EMCV NJ08株基因组5’末端的扩增  84-87
    1.7 EMCV NJ08株基因组3’末端的扩增  87-88
    1.8 片断F1-F5、5'末端和3’末端PCR产物的克隆与鉴定  88-89
    1.9 同源性比较  89-90
    1.10 系统进化分析  90-91
  2 结果  91-93
    2.1 病毒基因组分段扩增与测序  91
    2.2 基因组组成和结构  91-92
    2.3 核苷酸和推导的氨基酸比较  92-93
    2.4 基因进化树分析  93
  3 讨论  93-95
  参考文献  95-97
  ABSTRACT  97-99
第五章 脑心肌炎病毒SYBR Green Ⅰ实时PCR检测方法的建立  99-113
  摘要  99-100
  1 材料与方法  100-102
    1.1 病毒与样品  100
    1.2 主要试剂  100
    1.3 引物的设计与合成  100
    1.4 RNA提取  100-101
    1.5 cDNA合成  101
    1.6 实时PCR  101
    1.7 特异性  101-102
    1.8 敏感性  102
    1.9 重复性  102
    1.10 相对定量方法  102
    1.11 数据分析  102
  2 结果  102-108
    2.1 实时PCR反应条件及体系的优化  102-104
    2.2 实时PCR特异性  104-105
    2.3 实时PCR敏感性  105-106
    2.4 实时PCR重复性  106-107
    2.5 本方法与普通RT-PCR比较  107-108
  3 讨论  108-109
  参考文献  109-111
  ABSTRACT  111-113
第六章 靶向EMCV 1D和3AB基因shRNA重组质粒构建及其体内外抑制EMCV复制作用  113-137
  摘要  113-114
  1 材料与方法  114-123
    1.1 细胞、病毒及质粒  114
    1.2 主要试剂  114-115
    1.3 siRNA设计  115-116
    1.4 shRNA表达质粒构建与鉴定  116-117
    1.5 1D-EGFP、3AB-EGFP融合表达质粒的构建与鉴定  117-119
    1.6 EMCV 1D、3AB与EGFP基因融合表达  119-120
    1.7 shRNA表达质粒体外抑制EMCV复制实验  120
    1.8 shRNA抑制1D、3AB蛋白表达实验  120
    1.9 病毒滴度测定  120-121
    1.10 间接免疫荧光实验(IFA)  121
    1.11 实时PCR检测BHK-21细胞及小鼠脑组织中EMCV含量  121
    1.12 实时PCR  121
    1.13 shRNA表达质粒体内抑制EMCV复制  121-123
    1.14 统计分析  123
  2 结果  123-131
    2.1 shRNA表达质粒的构建与鉴定  123-124
    2.2 重组质粒ORFs-EGFP融合蛋白表达鉴定  124
    2.3 shRNA抑制EMCV细胞病变  124-125
    2.4 shRNA抑制EMCV在BHK-21细胞中复制  125-126
    2.5 shRNA抑制EMCV靶基因在HEK-293A细胞中表达  126-127
    2.6 shRNA减轻小鼠EMCV攻毒临床症状和病理变化  127-130
    2.7 shRNA抑制小鼠脑组织EMCV含量  130-131
  3 讨论  131-133
  参考文献  133-136
  ABSTRACT  136-137
第七章 靶向脑心肌炎病毒1D和3AB基因shRNA重组腺病毒的构建与鉴定  137-153
  摘要  137-138
  1 材料与方法  138-145
    1.1 质粒、菌株、病毒与细胞  138
    1.2 主要试剂  138
    1.3 引物设计与PCR扩增  138-139
    1.4 目的基因回收与纯化  139
    1.5 重组穿梭载体pAdTrack-CMV的构建  139-141
    1.6 重组穿梭载体与腺病毒骨架载体在大肠杆菌BJ5183中同源重组  141-143
    1.7 重组腺病毒的获得  143-145
  2 结果  145-148
    2.1 P_(H1)-shRNA表达框扩增与腺病毒穿梭载体构建  145-147
    2.2 腺病毒重组质粒构建与鉴定  147
    2.3 重组腺病毒收获及其滴度测定  147-148
    2.4 重组腺病毒基因组中PH_(H1)-shRNA表达框的PCR鉴定  148
  3 讨论  148-150
  参考文献  150-152
  ABSTRACT  152-153
第八章 腺病毒介导的靶向EMCV 1D和3AB基因shRNA体内外抑制EMCV复制作用  153-173
  摘要  153-154
  1 材料与方法  154-157
    1.1 病毒及细胞  154
    1.2 主要试剂  154
    1.3 病毒滴度测定  154
    1.4 间接免疫荧光试验(IFA)  154-155
    1.5 流式细胞分析(FACS)  155
    1.6 Western blot  155
    1.7 实时PCR  155-156
    1.8 重组腺病毒抑制EMCV在MARC-145细胞上的复制  156
    1.9 重组腺病毒抑制EMCV复制效果的持续性研究  156
    1.10 重组腺病毒对EMCV复制抑制作用的剂量依赖性  156
    1.11 重组腺病毒抑制EMCV在小鼠体内复制的效果评价  156-157
    1.12 统计分析  157
  2 结果  157-166
    2.1 重组腺病毒感染细胞剂量与培养时间选择  157
    2.2 重组腺病毒抑制EMCV在MARC-145细胞复制  157-158
    2.3 重组腺病毒抑制EMCV靶基因转录  158-159
    2.4 重组腺病毒抑制EMCV靶基因蛋白表达  159-160
    2.5 重组腺病毒抑制EMCV复制作用的持续性和剂量依赖性  160-161
    2.6 重组腺病毒抑制预先感染EMCV的复制作用  161-162
    2.7 重组腺病毒抑制小鼠EMCV复制  162-166
  3 讨论  166-168
  参考文献  168-171
  ABSTRACT  171-173
全文总结  173-175
攻读学位期间发表或完成论文  175-177
致谢  177

相似论文

  1. 鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1、N基因的序列分析,S852.65
  2. 靶向奶山羊BLG的慢病毒RNAi表达载体的构建及转基因细胞系的建立,S827
  3. 小鼠雌激素受体α重组腺病毒感染神经细胞及小鼠中枢神经系统的鉴定,R363
  4. 染色体结构维持蛋白SMC1A在胶质瘤中的调节作用研究,R96
  5. HBVprec/c shRNA慢病毒真核表达载体的构建及其对HBV增值的影响,R735.7
  6. NR4A1基因调控卵泡膜细胞激素生成的研究,R711.75
  7. SublyticC5b-9诱导Gadd45γ表达对Thy-1肾炎GMCs凋亡病变的影响,R692.3
  8. Intelectin在支气管哮喘气道炎症中作用的研究,R562.25
  9. 靶向大鼠血管平滑肌细胞STAT3的慢病毒干扰载体的构建及其效果鉴定的研究,R543
  10. ATF3在sublyticC5b-9复合物诱导GMCs凋亡中的作用,R363
  11. 转录因子Foxp3在肝癌中的表达及其生物学功能的研究,R735.7
  12. 壳聚糖-pGU6/GFP/Neo-shSTA纳米粒沉默stathmin基因对肺腺癌细胞化疗敏感性的影响,R734.2
  13. SublyticC5b-9诱导IRF-1表达对Thy-1肾炎大鼠GMCs凋亡病变的影响,R392
  14. IKKα/β-shRNA真核表达载体的构建及稳定低表达IKKβ HUVECs系的建立,R587.1
  15. ShRNA沉默ROCK1和ROCK2的表达对缺氧致大鼠心肌细胞凋亡的影响,R54
  16. 奶山羊催乳素受体（PrlR）基因CDS区的克隆、序列分析与腺病毒干扰载体的构建,S827
  17. 黄牛和水牛INHA基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定及功能研究,S823
  18. 稻米中8种矿质元素含量的QTL定位,S511
  19. 斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ ORF59基因的分析,S476
  20. 斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF56基因的特性分析,S476.1
  21. shRNA表达载体电穿孔胰腺癌Sw1990细胞沉默Livin基因的实验研究,R735.9

中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
© 2012 www.xueweilunwen.com