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鸭瘟病毒UL39基因的原核表达、转录与表达时相和亚细胞定位

作　者: 路国富
导　师: 程安春
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 鸭瘟病毒 UL39基因 原核表达 转录及表达时相 亚细胞定位
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


以本实验室构建的鸭瘟病毒中国强毒株(Duck plague virus Chinese virulent strain, DPV-CHv)基因文库及测序信息为基础,对DPV UL39基因的分子特征进行了分析。根据DPV-CHv UL39基因序列(GenBank登录号为EU071042)设计并合成PCR引物,成功扩增了UL39基因；原核表达并纯化UL39基因编码的蛋白-核糖核苷酸还原酶大亚基(the large subunit of ribonucleotide reductase,R1);制备兔抗R1多克隆抗体；在DPV感染鸭胚成纤维细胞(Duck embryo fibroblast,DEF)中对DPV UL39基因的转录和表达时相、表达产物的定位分布进行了分析。1.鸭瘟病毒UL39基因分子特性分析DPV UL39基因大小为2433bp,编码810aa。该蛋白有4个潜在的糖基化位点,40个潜在的磷酸化修饰位点,无信号肽和跨膜区。与GenBank上20种α疱疹病毒的同源基因进行多序列比对并构建了系统进化树,结果表明：DPV-CHv和α疱疹病毒亚科马立克病毒属(Mardivirus genus)里R1蛋白的亲缘关系最近。2. DPV R1的原核表达及多克隆抗体制备将用高保真酶PCR扩增的UL39基因产物送宝生物工程(大连)有限公司进行T克隆并测序,构建重组质粒pMD20-T-UL39。用BamHI和Hind Ⅲ双酶切pMD20-T-UL39重组质粒,回收纯化目的片段产物,定向插入经BamHI与Hindlll双酶切的pET-32a(+)载体,构建重组表达质粒pET-32a/UL39,转化入Rosetta(DE3),用IPTG诱导表达发现R1蛋白以包涵体形式为主,大小为110kDa左右。对表达条件进行优化,确定最佳条件为终浓度为0.4mmol/L的IPTG在30℃水浴诱导表达6h。采用切胶回收和电透析的方法对R1进行纯化,获得的重组蛋白纯度较高。用纯化蛋白和弗氏佐剂混匀后对家兔进行免疫,制备兔抗DPVR1多克隆抗体,琼脂扩散试验效价达1：16-1：32。3.DPV体外感染DEF后UL39基因转录和表达时相分析通过FQ-PCR对DPV UL39基因在DEF中的转录时相检测结果表明：DPV感染DEF后的转录产物2-4h开始能检测到,36h能检测到的UL39mRNA达到高峰,48h开始下降。采用DNA和蛋白质合成抑制试验研究UL39基因的基因类型。采用Western-blot法对DPV UL39基因表达时相分析,DPV感染3-6h时R1表达量很少,36h时R1的表达量达到高峰。综合分析判断以上试验结果可以推断DPV UL39基因为立即早期基因。4.DPV体外感染DEF后UL39基因产物的定位分析间接免疫荧光法检测DPV感染DEF后R1蛋白在DEF中的定位,发现特异性荧光主要集中在胞核周围。

全文目录


中文摘要  3-4
ABSTRACT  4-9
第一章 疱疹病毒UL39基因研究进展及选题目的和意义  9-16
  一、疱疹病毒UL39基因及其编码蛋白的研究进展  9-15
    1 Alpha疱疹病毒的特征和功能  9-13
      1.1 Alpha疱疹病毒的特征  9-11
      1.2 R1的功能  11-13
        1.2.1 R1和R2的相互作用  11
        1.2.2 HSV R1独特的N末端域的作用  11-12
        1.2.3 R1的抗凋亡功能  12
        1.2.4 HSV-1中以UL39为靶基因的siRNA效果  12
        1.2.5 PRV和VZV的R1缺失株研究  12-13
        1.2.6 R1的其他功能  13
    2 Beta疱疹病毒中R1的特征和功能作用  13-14
    3 Gamma疱疹病毒中R1的特征和功能作用  14-15
  二、选题目的和意义  15-16
第二章 鸭瘟病毒UL39基因的分子特性分析  16-22
  1 材料和方法  16-17
    1.1 基因序列  16
    1.2 方法  16-17
      1.2.1 核苷酸序列分子特性分析  17
      1.2.2 氨基酸序列分子特性分析  17
      1.2.3 稀有密码子分析  17
  2 结果  17-21
    2.1 DPV UL39基因序列相似性搜索结果  17-18
    2.2 根据UL39基因核苷酸序列推导的氨基酸序列分析结果  18
    2.3 磷酸化位点预测结果  18-19
    2.4 N-糖基化位点预测  19
    2.5 跨膜区预测  19
    2.6 信号肽切割位点预测  19-20
    2.7 R1蛋白亚细胞定位分析结果  20
    2.8 DPV UL39基因稀有密码子及Nc值分析  20
    2.9 系统进化树分析  20-21
  3 讨论  21-22
第三章 鸭瘟病毒UL39基因克隆、原核表达及多克隆抗体的制备  22-30
  1 材料  22-23
    1.1 试验动物  22
    1.2 毒株、菌株、载体和细胞  22
    1.3 主要试剂及配制  22-23
    1.4 仪器  23
    1.5 引物  23
  2 实验方法  23-26
    2.1 鸭胚成纤维细胞(DEF)的制备  23
    2.2 鸭瘟病毒(DPV)的培养  23
    2.3 DPV-CHv基因组的提取  23-24
    2.4 PCR扩增UL39基因  24
    2.5 pMD20-T-UL39质粒的构建和鉴定  24
    2.6 pET32a(+)-UL39融合表达质粒的构建和鉴定  24
    2.7 融合蛋白的诱导表达鉴定及条件优化  24-25
      2.7.1 制备表达宿主菌感受态细胞  24
      2.7.2 重组质粒转化表达宿主菌感受态细胞  24
      2.7.3 重组蛋白的诱导表达  24-25
      2.7.4 诱导表达条件的优化  25
    2.8 融合表达蛋白的纯化及免疫兔子  25
    2.9 多克隆抗体效价的测定  25-26
    2.10 Western-blot检测  26
    2.11 兔抗DPV UL39 IgG的纯化  26
  3 结果  26-29
    3.1 PCR扩增UL39基因  26
    3.2 pMD20-T-UL39质粒的鉴定  26-27
    3.3 pET32a(+)-UL39融合表达质粒的鉴定  27
    3.4 融合蛋白的诱导表达鉴定及条件优化  27-28
    3.5 融合表达蛋白的纯化  28
    3.6 多克隆抗体效价的测定结果  28
    3.7 兔抗DPV UL39 IgG的纯化结果  28-29
    3.8 Western blot检测结果  29
  4 讨论  29-30
第四章 DPV体外感染宿主细胞UL39基因转录、表达时相及药物抑制试验分析  30-37
  1 试验材料  30
    1.1 试剂及其配制  30
    1.2 仪器  30
  2 试验方法  30-33
    2.1 FQ-RT-PCR检测DPV体外感染宿主细胞时UL39基因的转录情况  30-32
      2.1.1 引物的设计与合成  30
      2.1.2 引物的特异性检测  30-31
      2.1.3 FQ-PCR标准曲线的构建  31
      2.1.4 DEF的培养及总RNA的提取  31
      2.1.5 RNA的完整性检测  31
      2.1.6 去除总RNA中的基因组DNA  31
      2.1.7 反转录并进行FQ-PCR检测  31-32
    2.2 药物抑制试验确定UL39的基因类型  32
    2.3 R1蛋白体外表达动力学研究  32-33
      2.3.1 DEF的培养及细胞蛋白的提取  32
      2.3.2 Western-blot检测  32-33
  3 试验结果  33-35
    3.1 DPV UL39基因转录时相分析  33-35
      3.1.1 FQ-PCR引物特异性检测  33
      3.1.2 FQ-PCR标准曲线的构建  33-34
      3.1.3 RNA的完整性检测  34
      3.1.4 样品检测和结果分析  34-35
    3.2 药物抑制试验鉴定UL39基因类型  35
    3.3 DPV R1蛋白表达时相结果分析  35
  4 讨论  35-37
    4.1 RQ-RT-PCR检测DPV UL39基因转录特征  35-36
    4.2 更昔洛韦和放线菌酮抑制疱疹病毒核酸和蛋白合成  36
    4.3 Western blot检测R1蛋白在感染DPV的DEF中的表达动力学  36-37
第五章 鸭瘟病毒UL39基因编码蛋白在DEF中的定位研究  37-40
  1 试验材料  37
    1.1 毒株和细胞  37
    1.2 主要试剂及配制  37
    1.3 仪器设备  37
  2 试验方法  37-38
    2.1 间接免疫荧光检测DPV UL39基因编码蛋白在DEF中的分布情况  37-38
    2.2 结果判定标准  38
    2.3 DPV UL39基因产物亚细胞定位的动态监测  38
  3 结果  38-39
  4 讨论  39-40
结论  40-41
参考文献  41-46
致谢  46-47
作者简介  47

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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