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银杏内生真菌Chaetomium globosum CDW7次生代谢产物研究

作　者: 肖玉
导　师: 叶永浩
学　校: 南京农业大学
专　业: 农药学
关键词: 银杏内生真菌抗菌抗氧化 flavipin 球毛壳菌球毛壳菌素发酵条件优化
分类号: S792.95
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

植物内生真菌分布广泛,其次生代谢产物具有丰富的化学结构多样性,被认为是生物活性物质的重要资源。内生菌在与宿主植物协同进化过程中,能够合成活性物质协助宿主抵御外来病原物侵染或逆境胁迫。银杏是现存的地球上最古老的树种之一,具有很高的研究开发价值,在其生长期间很少感染病虫害且寿命极长,从中极有可能发现具备良好活性的内生菌株。因而,研究银杏内生真菌及其次生代谢产物具有重要的理论意义和应用前景。本文以小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)和辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)为测试靶标菌,采用琼脂扩散法从80株银杏内生真菌中筛选具有抗植物病原真菌活性的菌株。结果显示,15株内生菌株具有一定的抑制植物病原真菌活性,其中菌株CDW7对3种测试菌均具有较强的抑制活性。通过形态学和分子生物学方法鉴定该菌株为毛壳属球毛壳菌(Chaetomium globosum)。菌株CDW7发酵液对小麦赤霉病菌平板抑菌活性研究表明,稀释3倍后的PD发酵液能完全抑制小麦赤霉病菌的菌丝生长和孢子萌发；温室实验表明,PD发酵液对小麦赤霉病的保护和治疗作用防效分别达54.9%和48.8%。采用活性追踪快速分离方法,从CDW7发酵液二氯甲烷萃取物中分离获得6个化合物(LB-1-LB-6),包括5种球毛壳菌素和1种苯二醛衍生物黄柄曲菌素(flavipin,1,2-benzenedicarboxaldehyde-3,4,5-trihydroxy-6-methyl, LB-6)。5种球毛壳菌素中,3种为已知化合物,分别为chaetoglobosin A (LB-3)、chaetoglobosin C (LB-5)和chaetoglobosin F (LB-2),2种为新结构化合物,分别命名为21-methoxy-chaetoglobosin F (LB-1)和chaetoglobosin Y (LB-4)。抗菌活性测试显示,化合物flavipin和chaetoglobosin A对多种植物病原真菌具有较强的抑制活性。其中,flavipin对小麦赤霉病菌的EC50值为0.73μg/mL,与阳性对照多菌灵(0.5μg/mL)相当：化合物chaetoglobosin A对油菜菌核病菌、小麦赤霉病菌、辣椒疫霉病菌和番茄早疫病菌ECso均在1.0μg/mL以下。本研究同时采用DPPH自由基清除法(DPPH)和铁离子还原法(FRAP),对80株银杏内生真菌代谢物抗氧化活性进行筛选,得到7株代谢物具有抗氧化活性的菌株,分别鉴定为球毛壳菌(Chaetomium globosum CDW7)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides NJSC8)、裂褶菌(Schizophyllum commune NJSP73)、拟茎点霉属(Phomopsis sp. NJWP10)、白囊齿耙菌(Irpex lacteus NJWP72)、毛壳菌属(Chaetomium sp.TXCP41)和青霉属(Penicillium sp. TXP58)。其中,菌株CDW7代谢物具有较强的抗氧化活性,DPPH法中IC50值为6.33μg/mL,FRAP法中C0.5FRAP值为30.78μg/mL,和阳性对照Vitamin C相当。利用活性指导分离,从菌株CDW7发酵液代谢物中得到化合物黄柄曲菌素(flavipin, LB-6)。体外(DPPH、ABTS、FRAP、ORAC、LPO)和体内(SOD、GSH-Px、MDA)抗氧化活性实验结果证明,flavipin具有显著的抗氧化能力,可作为新型抗氧化剂进行进一步开发。由于菌株CDW7能产生具有抗菌、抗氧化活性的次生代谢物flavipin。本研究以flavipin产量为指导,对该菌株的发酵条件进行优化,得到最佳条件为25℃,100mL/250mL瓶,12菌饼/250mL瓶,150rpm, pH6.5, PD培养基发酵14天,flavipin产量达315.5mg/L。相关性统计结果显示,flavipin产量和CDW7发酵液粗提物抗氧化活性呈正相关关系,决定系数为0.8235,表明化合物flavipin是菌株CDW7代谢物中的主要抗氧化物质。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
缩略语  10-11
第一章植物内生真菌抗植物病原真菌活性物质研究进展  11-29
  1 生物碱(Alkaloids)  11-13
  2 甾体类(Steroids)  13-14
  3 萜类及其衍生物(Terpenoids)  14-15
  4 醌类(Quinones)  15-18
  5 酚类及有机酸类(Phenols)  18-22
  6 肽类(Peptide)  22-23
  7 酯类(Esters)  23-24
  8 其他(Others)  24-29
第二章银杏内生真菌CDW7抗菌活性次生代谢产物研究  29-49
  1 材料与方法  30-34
    1.1 材料  30-31
    1.2 实验方法  31-33
    1.3 统计分析  33-34
  2 结果与分析  34-47
    2.1 内生真菌抗菌活性菌株筛选  34-35
    2.2 菌株CDW7菌种鉴定  35-36
    2.3 菌株CDW7发酵液对小麦赤霉病菌抑制活性  36-37
    2.4 菌株CDW7次生代谢产物分离纯化及鉴定  37-46
    2.5 化合物抗菌活性测定  46-47
  3 小结与讨论  47-49
第三章银杏内生真菌CDW7抗氧化活性次生代谢产物研究  49-65
  1 材料与方法  49-55
    1.1 材料  49-50
    1.2 实验方法  50-55
  2 结果与分析  55-63
    2.1 内生真菌抗氧化活性菌株的筛选及鉴定  55-56
    2.2 次生代谢产物flavipin抗氧化活性测定  56-57
    2.3 以flavipin产量为导向的CDW7发酵条件优化  57-62
    2.4 菌株CDW7代谢产物抗氧化活性与flavipin含量之间的关系  62-63
  3 小结与讨论  63-65
全文总结  65-67
参考文献  67-75
附录  75-95
致谢  95-97
攻读硕士学位期间发表的论文及申请专利  97

银杏内生真菌Chaetomium globosum CDW7次生代谢产物研究

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