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基于thyA基因的乳酸乳球菌表达系统的构建及纳豆激酶基因的克隆

作　者: 董慧
导　师: 田洪涛
学　校: 河北农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 胸腺嘧啶合成酶基因thyA 大肠杆菌 IS1 乳酸乳球菌嗜热链球菌纳豆激酶染色体-质粒互补系统
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

乳酸菌是一类能利用碳水化合物产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的通称，被公认为是安全的食品级微生物。其中乳酸乳球菌是乳酸菌研究的模式菌株，成为继大肠杆菌、枯草芽孢杆菌之后最受关注的外源基因表达宿主。为了在基因修饰时进行有效的筛选并保持选择压力，目前已构建的乳酸菌的基因克隆与表达系统大都采用以抗生素抗性基因作为选择标记，作为耐药性基因的贮存宿主，抗药性基因会向其他共生的菌株转移，将给生物安全性带来很大隐患。因此，采用食品级的选择标记基因替代抗生素抗性标记已成为目前研究的热点。thyA是一种广泛存在于噬菌体、原核、真核细胞中的必需基因，编码胸腺嘧啶合成酶，是dTMP从头合成途径中的关键酶。因此，thyA的缺陷会导致细菌DNA合成受限而死亡，只有在基本培养基中加入胸腺嘧啶或胸腺嘧啶核苷或者获得含有胸腺嘧啶合成酶基因的质粒后，其缺陷菌株方可生长。本文通过含4%葡萄糖及1.25μg/mL链霉素的培养基培养大肠杆菌E.coliDH5α，诱导提高其内源性插入序列IS1的转座频率，优化了TMP定向筛选方法，成功筛选到了胸腺嘧啶合成酶缺陷型的大肠杆菌D8。该菌株的thyA基因编码区起始密码子ATG后的第118个碱基处插入了一个完整的IS1序列，且第109-118个碱基（AACCTGCAAG）发生了正向重复，目前尚未见插入位点产生10bp的正向重复序列的报道。该方法为利用大肠杆菌内源性插入序列构建缺陷型菌株奠定了基础，得到的D8菌株可利用外源thyA基因恢复在基础培养基上的生长能力，可作为以thyA基因为标记的食品级载体的宿主，便于给基因工程操作，完善了以thyA基因为互补标记的乳酸乳球菌的染色体-质粒互补表达系统。本研究以分离国内自发酵乳制品的嗜热链球菌St-JY的基因组为模板，扩增了其胸腺嘧啶合成酶基因thyA的全序列，以该基因替换了乳酸乳球菌的表达载体pMG36e的红霉素抗性基因，构建食品级的表达载体pMGthyA。载体上仅有来自乳酸乳球菌内源性质粒pWV01的复制子，嗜热链球菌的thyA基因片段以及来pUC18的一段多克隆位点。并以地衣芽孢杆菌的淀粉酶基因amy为报告基因，构建了重组载体pMGthyA-amy并转化入thyA缺陷型宿主乳酸乳球菌L.lactis MG1363-TT，重组菌株可在含可溶性淀粉的平板上形成肉眼可见的菌落，滴加碘液后形成明显的透明圈。此外，克隆了来自日本的纳豆发酵菌株纳豆芽孢杆菌中包含纳豆激酶信号肽、前导肽及成熟肽的序列pre-pro-NK，包含前导肽与成熟肽的序列pre-NK以及成熟肽序列NK，将此三段序列分别克隆至食品级表达载体pMGthyA的多克隆位点处，并将重组质粒转化入乳酸乳球菌，为研究纳豆激酶在乳酸菌中的表达奠定了基础。本研究中所构建的不含抗生素抗性标记基因的载体pMGthyA可稳定存在于thyA缺陷型菌株E.coli D8及L.lactis MG1363-TT中，实现了质粒的稳定遗传，分别构成了的无抗生素标记的大肠杆菌染色体-质粒互补系统与乳酸乳球菌染色体-质粒互补系统，为乳酸乳球菌外源基因的食品级表达创造了条件。

基于thyA基因的乳酸乳球菌表达系统的构建及纳豆激酶基因的克隆

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