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海洋颉颃菌的筛选及其对核盘菌抑制作用的研究

作　者: 葛平华
导　师: 马桂珍；刘兆普
学　校: 南京农业大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 解淀粉芽孢杆菌鉴定抑菌作用稳定性发酵条件优化分离纯化
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

核盘菌是引起油菜、大豆等多种植物菌核病的重要植物病原真菌,该菌能以菌核形态在土壤中长期存活,是生产上难防病害。本研究从连云港海域分离筛选到一株对核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)等多种植物病菌均具有强烈抑制作用的解淀粉芽孢菌菌株GM-1,系统研究了该菌株抑菌作用机制及发酵液稳定性,并对其进行了产抗菌活性物质发酵条件优化及活性组分初步分离纯化,主要研究内容和结论如下：1.抗核盘菌优良菌株的筛选。从连云港海域海水、海泥及海洋动物样品中共分离得到微生物菌株220株,其中细菌171株、放线菌32株、真菌17株,采用对峙培养法测定不同菌株对核盘菌的抑制作用,共筛选到具有较强抗菌作用的菌株34株,比例为15.45%,其中细菌菌株数量最多,为27株；选取抗菌作用较强的6株细菌和2株放线菌进行复筛,结果显示8个菌株对核盘菌及其他8种植物病原真菌有较强的抑菌作用,其中细菌GM-1菌株的抑菌作用最强,对9种植物病原菌均有很强抑制作用,具有较广的抗菌谱。2.细菌GM-1菌株的种类鉴定。通过形态特征观察、生理生化试验,初步判断该菌株属于芽孢杆菌属。提取菌株基因组总DNA, PCR扩增,得到16S rDNA序列及gyrB基因序列,将扩增序列在GenBank中分别进行同源性比对,并构建系统发育树。结果显示,GM-1菌株与芽孢杆菌属(Bacillus)的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens AB014097.1)的序列同源性达到99%,结合形态学观察和生理生化试验结果,认为GM-1菌株为解淀粉芽孢杆菌。3.菌株GM-1发酵液的抗菌谱、稳定性测定。以10种植物病原真菌和细菌为供试菌,采用牛津杯法,测定GM-1菌株发酵液的抗菌谱,以核盘菌为指示菌,采用生长速率法测定发酵液在不同条件下抗菌作用稳定性；结果表明,GM-1菌株发酵液对供试的10种植物病原菌和2种细菌具有较强的抑制作用,其中对葡萄白腐病菌(Coniella diplodiella)和小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)的抑菌带宽度达3.40cm以上,抗菌范围较广；其发酵液的抗菌作用有较好的热稳定性、在光照和紫外线照射下稳定性较好、在pH值6-8的条件下抗菌作用稳定、对蛋白酶不敏感。GM-1菌株具有广谱抗菌活性和较强的稳定性。4.菌株GM-1抗菌作用及对油菜菌核病的防病效果测定。采用对峙培养方法和牛津杯法测定GM-1菌株对核盘菌抗菌作用以及对菌核萌发的抑制作用,显微观察对核盘菌菌丝的破坏作用,采用平板透明圈法测定GM-1菌株产细胞壁降解酶酶活性,采用盆栽试验测定GM-1菌株对油菜菌核病的防病效果,结果表明：GM-1菌株和无菌发酵液对核盘菌菌丝的生长具有明显的抑制作用,培养7d的抑菌带宽度分别达到30mm和16mm; GM-1菌株和无菌发酵液对菌丝细胞结构有明显的破坏作用,导致菌丝细胞壁变厚、膨大；同时对菌核的萌发有明显的抑制作用,菌液的抑制作用明显高于无菌发酵液。盆栽防病效果测定表明：GM-1菌株菌液对油菜菌核病具有明显的防治作用,防治效果达68%,同时能够促进油菜种子萌发,显示出良好的开发应用前景。5.菌株GM-1菌体生长和产抗菌物质的发酵培养基配方和发酵条件优化。以菌体密度和无菌滤液对核盘菌的抑制作用为检测指标,采用单因素试验筛选GM-1菌株生长及产抗菌物质培养的最佳碳源、氮源和无机盐,通过正交试验设计对该菌株生长和产抗菌物质的发酵培养基配方和摇瓶发酵条件进行优化。研究结果表明,GM-1菌株生长及产抗菌物质最佳培养基配方为：蔗糖10g/L,牛肉膏16g/L,酵母膏3g/L,FeSO40.4g/L。最佳发酵条件为28℃,pH7.0,200r/min摇床培养60h,种子液浓度108cfu/mL接种量为10%,装液量为70mL/250m/L.6.菌株GM-1抗真菌活性组分的分离纯化。采用硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析、制备薄层层析技术,以核盘菌为指示菌进行抗真菌活性组分抑菌活性跟踪,通过薄层层析和HPLC等技术,检测纯度,对海洋解淀粉芽孢杆菌GM-1抗真菌活性组分进行分离纯化,得到了2种具有强抗菌作用的组分2和A1。

全文目录

目录  4-6
摘要  6-8
ABSTRACT  8-11
第一部分文献综述  11-23
  第一章油菜菌核病防治的研究概况  11-23
    1 油菜菌核病病原及其病害循环  11-12
    2 油菜菌核病主要症状  12
    3 油菜菌核病主要防治措施  12
    4 微生物在油菜菌核病防治中的应用  12-17
    5 生物防治存在的问题和展望  17
    6 课题研究的目的意义  17-19
    参考文献  19-23
第二部分实验内容  23-93
  第一章核盘菌颉颃菌的分离、筛选  23-31
    1 材料和方法  23-25
    2 结果与分析  25-29
    3. 结论与讨论  29-30
    参考文献  30-31
  第二章核盘菌颉颃海洋细菌GM-1菌株的种类鉴定  31-45
    1 材料和方法  31-36
    2 结果讨论  36-41
    3 结论与讨论  41-43
    参考文献  43-45
  第三章 GM-1菌株发酵液抗菌谱、稳定性  45-55
    1 材料与方法  45-47
    2 结果与分析  47-52
    3 结论与讨论  52-53
    参考文献  53-55
  第四章 GM-1菌株抑菌作用研究  55-65
    1 材料和方法  55-58
    2 结果与分析  58-61
    3 结论与讨论  61-63
    参考文献  63-65
  第五章 GM-1菌株培养基及摇瓶发酵条件优化  65-81
    1 材料与方法  65-68
    2 结果与分析  68-78
    3 结论与讨论  78-79
    参考文献  79-81
  第六章海洋细菌GM-1抗菌活性物质初步分离纯化  81-93
    1 材料与方法  81-85
    2 结果与分析  85-91
    3 结论与讨论  91-92
    参考文献  92-93
全文结论  93-95
创新点  95-97
致谢  97-99
攻读硕士学位论文期间发表论文  99

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